李海龍

撫順市第二醫(yī)院(遼寧 撫順 113000)

七氟醚是一種芳香、無刺激的無色透明液體，化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，與鈉石灰反應(yīng)生成五種物質(zhì)，易于被小兒患者接受。優(yōu)點有：麻醉誘導(dǎo)快、維持麻醉平穩(wěn)、易于調(diào)節(jié)麻醉深度、蘇醒快、保護心肌等[1]。因此，近年來七氟醚被眾多麻醉學(xué)者所鐘愛，稱其為吸入麻醉藥物的里程碑，七氟醚的麻醉誘導(dǎo)以及麻醉維持在小兒麻醉領(lǐng)域更是具有多種顯著優(yōu)勢。但有研究表明，七氟醚對發(fā)育期中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定毒性作用，可引起神經(jīng)發(fā)育障礙[2]。兒童早期接觸七氟醚可增加青春期學(xué)習(xí)障礙的發(fā)生率[3]。關(guān)于七氟烷麻醉藥引起的發(fā)育神經(jīng)毒性的機制目前雖有學(xué)者基于不同模型進(jìn)行研究，但還不是十分清楚透徹。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析及計算機技術(shù)，通過“藥物-靶標(biāo)-基因-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析，探索藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)[4]。通過疾病-基因-靶點-藥物相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以將單個靶點或多個靶點在整個生物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定位，加速藥物靶點的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)而分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，使研究者可以全面地了解疾病病理基礎(chǔ)與藥物治療作用。

為進(jìn)一步闡明七氟烷麻醉藥引起的發(fā)育神經(jīng)毒性的機制，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，運用Drugbank、GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索七氟烷及發(fā)育神經(jīng)毒性的相關(guān)靶點,構(gòu)建“藥物-靶點-基因-疾病”模型及互作網(wǎng)絡(luò)，并對其交集靶點進(jìn)行生物信息學(xué)分析，闡明其可能的作用機制，為后續(xù)實驗及臨床提供研究基礎(chǔ)及思路。

1 研究方法

1.1 獲取七氟烷的藥物靶點

使用DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)檢索七氟烷(sevoflurane)并提取相關(guān)的靶點基因。

1.2 檢索發(fā)育神經(jīng)毒性靶點基因

使用Gene Cards(The Human Gene Database,https：//www.geneca-rds.org/)，檢索“development Neurotoxic”，通過“export to excel”輸出Excel表格，并查找出七氟烷與發(fā)育神經(jīng)毒性的靶點基因交集，繪制韋恩圖。

1.3 氟烷-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將七氟烷靶點相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape_v3.7.1軟件，繪制七氟烷靶點網(wǎng)絡(luò)；使用STRING平臺(STRING version:10.5https：//string-db.org/)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI network)。打開STRING頁面，選擇“Multiple proteins”，將上面1.2得到在靶點基因復(fù)制到“List Of Names”中，“Organism”中選擇“Homo sapiens”，其余參數(shù)保持默認(rèn)狀態(tài)，以此可構(gòu)建這些潛在靶點之間的蛋白作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO分析和KEGG通路富集分析

使用R語言軟件對七氟烷與發(fā)育神經(jīng)毒性的共同作靶點進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換；在R語言中調(diào)用bioconductor程序包進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理；運行R語言分別得到GO和KEGG富集分析的條形圖、氣泡圖、通路圖；使用Perl將轉(zhuǎn)換的ID變成原始基因靶點。

1.5 相關(guān)軟件

R語言Rx64 3.5.3及VennDiagram包、count.R包，clusterProfiler包、org.Hs.eg.db包、symbol2id包，UltraEdit，Java1.8.0_201-b09，“Perl”addSymbol.pl腳本，Cytoscape_v3.7.1。

2 結(jié)果分析

2.1 七氟烷藥物相關(guān)靶點

經(jīng)過檢索DrugBank數(shù)據(jù)庫，提取到七氟烷22個相關(guān)靶點，如表1所示。

表1 七氟烷藥物相關(guān)靶點

2.2 發(fā)育神經(jīng)毒性相關(guān)靶點

在Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“development Neurotoxic”為檢索詞查找發(fā)育神經(jīng)毒性靶點信息，共得到靶點1157個。將七氟烷靶點與發(fā)育神經(jīng)毒性靶點信息進(jìn)行比對并取交集，共得到靶點11個，即為七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性的潛在作用靶點。如圖1所示。

圖1 七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性的潛在作用靶點

2.3 七氟烷-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)

將映射后的交集靶基因與七氟烷，采用Cytoscape-v3.7.1軟件可視化分析，得到“七氟烷-靶點-發(fā)育神經(jīng)毒性”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2所示。此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點13個，其中11個節(jié)代表靶點，1個節(jié)點代表七氟烷，1個節(jié)點代表發(fā)育神經(jīng)毒性，共有邊21條。粉色V形節(jié)點代表七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性的候選靶點，紅色六角形節(jié)點代表發(fā)育神經(jīng)毒性，藍(lán)色矩形代表七氟烷。邊代表七氟烷與靶點的關(guān)系及發(fā)育神經(jīng)毒性與靶點的關(guān)系。由圖可知，七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性多靶標(biāo)的特點。將交集得到的靶點運用STRING數(shù)據(jù)庫獲得蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)，選取置信度得分>0.7的數(shù)據(jù)，構(gòu)建七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖3所示。

圖2 “七氟烷-靶點-發(fā)育神經(jīng)毒性”網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 七氟烷致發(fā)育神經(jīng)毒性靶點PPI

2.4 GO富集分析

對11個交集靶基因，采用R語言symbol2id包，定義log2FC為1，在“org.Hs.eg.db”數(shù)據(jù)庫中搜索，將gene name轉(zhuǎn)化為geneID，得到輸入文件，如表2所示。

表2 七氟烷發(fā)育神經(jīng)毒性作用靶點ID轉(zhuǎn)化

采用R語言bioconductor包、clusterProfiler包及id2symbol.pl腳本，在GO數(shù)據(jù)庫中檢索，fisher精確檢驗，pvalueCutoff=0.05，qvalueCutoff=0.05。

GO功能(細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過程)富集分析，共獲得具有顯著意義的條目共35條，根據(jù)校正的P值排序，取排名前20的路徑，如圖4所示。富集越多顯著顏色越偏紅色，富集越少顏色越偏藍(lán)色；橫坐標(biāo)表示富集數(shù)目，縱坐標(biāo)表示涉及到的功能。結(jié)果表明，靶標(biāo)基因主要涉及的分子生物學(xué)功能為GABA-A receptor activity(GABA-A受體活性)、transmitter-gated ion channel activity involved in regulation of postsynaptic membrane potential(參與傳遞離子通道活性的突觸后膜電位的調(diào)節(jié))、neurotransmitter receptor activity involved in regulation of postsynaptic membrane potential(神經(jīng)遞質(zhì)受體活動參與突觸后膜電位的調(diào)節(jié))、GABA receptor activity(GABA 受體活性)、transmitter-gated ion channel activity(傳送門控離子通道活性)、inhibitory extracellular ligand-gated ion channel activity(抑制細(xì)胞外配體門控離子通道活性)、ligand-gated anion channel activity(配體門控陰離子通道活性)、benzodiazepine receptor activity(苯二氮受體活性)、neurotransmitter receptor activity(神經(jīng)遞質(zhì)受體的活性)等。

圖4 靶標(biāo)基因GO富集分析top20

2.5 KEGG富集分析

采用R語言bioconductor包、clusterProfiler包及id2symbol.pl腳本，在KEGG數(shù)據(jù)庫中檢索，fisher精確檢驗，pvalueCutoff=0.05，qvalueCutoff=0.05。KEGG通路富集分析，共富集具有顯著意義7條信號通路，根據(jù)校正的P值排序，如圖5所示。七氟烷對發(fā)育神經(jīng)毒性的與Nicotine addiction(尼古丁成癮)、Retrograde endocannabinoid signaling(逆行內(nèi)源性大麻素信號傳導(dǎo))、GABAergic synapse(GABA能突觸)、Morphine addiction(嗎啡成癮)、Neuroactive ligand-receptor interaction(神經(jīng)活性配體受體相互作用)、Taste transduction(味覺傳導(dǎo))、Serotonergic synapse(5-羥色胺能突觸)有關(guān)。

圖5 靶標(biāo)基因KEGG富集分析

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)由Andrew L Hopkins在2007年首次提出[5]，它是在系統(tǒng)生物學(xué)、計算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、分子藥理學(xué)、多向藥理學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，運用網(wǎng)絡(luò)分析手段，從整體水平出發(fā)，構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”等分析網(wǎng)絡(luò)，探索藥物、靶點、機體相互作用關(guān)系，具有系統(tǒng)性、整體性。

近年來，越來越多的數(shù)據(jù)表明七氟烷麻醉可能對神經(jīng)具有潛在的毒性從而會引發(fā)各種臨床并發(fā)癥，其中較為常見的有術(shù)后認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)發(fā)育損傷等。本研究對七氟烷與發(fā)育神經(jīng)毒性進(jìn)行分析，在信號通路富集結(jié)果中Retrograde endocannabinoid signaling通路是最值得我們關(guān)注的。有研究表明，七氟烷可能通過激活PI3K/Akt信號通路增加Cx43蛋白表達(dá)，并誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡，增加幼鼠認(rèn)知功能損傷[6]。進(jìn)一步通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)GSK3β,p44/p42-MAPK以及MAPK2磷酸化水平和異氟烷及七氟烷介導(dǎo)的神經(jīng)毒性有關(guān)，之后有學(xué)者也通過分子生物學(xué)實驗進(jìn)行了驗證[7]。通過KEGG的Retrograde endocannabinoid signaling信號通路圖(圖5)，我們可以看出在通路中，MAPK信號通路起核心調(diào)控作用，七氟烷麻醉時對發(fā)育神經(jīng)的影響，可能是通過激活MAPK信號通路，進(jìn)而影響其上下游通路，如PI3K/Akt信號通路。通過KEGG富集結(jié)果可知，在Retrograde endocannabinoid signaling中，富集的重要的靶基因有GABRA1、GRIA1、GABRA2、GABRA3、GABRA4、GABRA5、GABRA6、GABRB2、GABRB3、GABRE。關(guān)于這些靶點及信號通路在今后的研究中還需要進(jìn)一步通過動物模型實驗和細(xì)胞生物學(xué)實驗進(jìn)行驗證，本研究可為科研實驗提供了新思路。