樊廷俊, 李 琨, 趙 君

(中國海洋大學海洋生命學院， 山東 青島 266003)

膠原蛋白是動物界中最豐富的細胞外基質(zhì)蛋白，屬于纖維蛋白家族，在進化中高度保守，廣泛存在于韌帶、肌腱、附睪等結締組織以及胃腸道和泌尿生殖道在內(nèi)的大多數(shù)中空器官中，并且在皮膚的真皮、角膜、鞏膜、軟骨和骨骼中含量也很豐富[1]。目前為止，根據(jù)其結構差異已經(jīng)鑒定出至少29種膠原，其中人體超過90%的膠原蛋白是Ⅰ型，而其他常見的膠原蛋白類型包括Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型等。膠原蛋白不但為組織和器官提供了關鍵的結構支撐，更為細胞提供了高度生物相容性的環(huán)境。鑒于上述優(yōu)點，膠原蛋白現(xiàn)已廣泛用于3D細胞培養(yǎng)及藥物遞送等各個領域，同時高生物相容性、可生物降解性，易得性及低免疫原性等特性，使得膠原蛋白成為組織工程用生物材料的理想來源[2]。

傳統(tǒng)上，商業(yè)膠原蛋白主要從陸生哺乳動物(例如牛和豬)中提取，然而，近年來牛海綿狀腦病、可傳播性海綿狀腦病和口蹄疫的爆發(fā)，日益增加了人們對使用陸生動物膠原蛋白和膠原衍生產(chǎn)品的擔憂。同時，陸生哺乳動物膠原存在純化困難且造價昂貴等問題。此外，由于宗教信仰，印度教禁用牛膠原蛋白，伊斯蘭和猶太文化禁用豬膠原蛋白。因此，迫切需要開發(fā)一種新的膠原蛋白來源，以替代陸生哺乳動物的膠原蛋白[3-4]。

地球超過70%的面積被海洋所覆蓋，海洋生物是生物活性化合物的豐富來源。迄今為止，已經(jīng)從海洋資源中分離出多種生物成分。其中，海洋源性的膠原蛋白不但在氨基酸組成和生物相容性方面與傳統(tǒng)的陸生哺乳動物膠原蛋白相似，且比哺乳動物膠原蛋白有著更高的優(yōu)勢，表現(xiàn)在來源廣泛、易于提取、不存在病原微生物污染且具有穩(wěn)定的化學和物理特性等，特別是在魚類加工業(yè)和漁業(yè)活動中，魚和海膽的廢料、尺寸過小的魚以及副漁獲物(例如水母、海星、海綿等)含有豐富的膠原蛋白，可能會成為重要但未被充分利用的膠原蛋白來源[3]。鑒于膠原蛋白在進化中具有高度保守性，廣大的科研工作者便將目光投向了海洋生物膠原，這掀起了研究海洋生物膠原的熱潮，其作為組織工程領域中重要的生物材料的可能性日益增加。因此，本文對海洋源性膠原蛋白的來源、特性及提取工藝進行了概述，并對其目前作為生物材料在組織工程中的應用進展進行了重點闡述，同時展望了海洋源性膠原蛋白作為理想組織和器官再生材料來源的可能性。

1 海洋膠原蛋白的主要來源

海洋環(huán)境是膠原蛋白和生物活性物質(zhì)的重要來源，按照動物類型不同，目前海洋膠原蛋白基本可以來源于兩類：一類為海洋無脊椎動物，包括海蜇、海膽和水母等[5-16]；另一類為海洋脊椎動物，包括魚和各種海洋哺乳動物[17-25]。目前，從海洋生物中提取的膠原蛋白用于組織工程生物材料的研究主要集中在海洋魚類、水母及海綿等，這些海洋生物的皮膚、肌肉、軟骨組織及中膠層等部位含有豐富的膠原蛋白[4]。

海洋魚類中，膠原蛋白通常是從肉、皮膚、骨頭、鰭、鱗片和魚渣中提取得到，以Ⅰ型膠原蛋白為主。提取的魚膠原蛋白通過純化，其小分子片段可以用于化妝品的制備及營養(yǎng)等領域，其大分子則經(jīng)過進一步加工形成功能性生物材料，用于組織工程的支架，包括膠原海綿、凝膠、復合材料和膜等。來源于海洋魚類的膠原蛋白目前大部分來自加工業(yè)產(chǎn)生的魚類廢物，研究表明從這些丟棄物中提取的膠原蛋白的干質(zhì)量可達50%以上。因此，這種廢料具有被開發(fā)為生態(tài)友好且低成本的膠原蛋白來源的巨大潛力[17-24]。

水母是一類膠質(zhì)狀的浮游生物，屬刺胞動物門，在中國近海海域分布廣泛。來源于水母的膠原蛋白主要是從水母中膠層中提取得到的，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ及Ⅺ型膠原蛋白，目前作為組織工程用生物材料已被用于傷口敷料及鼻軟骨的修復等[9-10]。

海洋海綿是最原始的多細胞動物，其主要成分是碳酸鈣或碳酸硅以及大量的膠原蛋白，已知其含有Ⅳ型膠原蛋白。研究發(fā)現(xiàn)海綿膠原蛋白可以提高皮膚成纖維細胞的增殖速度并保護其免受紫外線誘導的細胞死亡，有望用于皮膚的光老化修復[13-16]。

海洋膠原蛋白還可以從鯨魚、海豹、海獺和北極熊等海洋哺乳動物中提取。例如小須鯨腹溝中可以提取到Ⅰ型膠原蛋白，提示其可以作為陸生哺乳動物膠原蛋白的替代物[25]。然而，直到現(xiàn)在，海洋哺乳動物仍很少被用于膠原蛋白的開發(fā)。本文作者對過去十年中從海洋來源獲得的不同類型的膠原蛋白及其潛在用途進行了總結(見表1)。

表1 海洋源性膠原蛋白的主要來源、類型及應用領域

2 海洋膠原蛋白的特性

眾多數(shù)據(jù)證明，海洋源性的膠原蛋白具有與陸生動物膠原蛋白相似的理化性質(zhì)。與陸生動物來源的Ⅰ型膠原蛋白相比，源自海洋硬骨魚的Ⅰ型膠原蛋白被發(fā)現(xiàn)其膠原α1和α2鏈與陸生動物表現(xiàn)出高度的結構相似性[26]。然而海洋源性膠原蛋白在稀酸溶液中表現(xiàn)出的極高溶解度說明，其與陸生動物膠原蛋白一定具有不同的特性[27]。

2.1 氨基酸組成

海洋源性膠原蛋白的生化組成被發(fā)現(xiàn)與哺乳動物膠原蛋白不同。之前的研究已經(jīng)證明，海洋源性膠原蛋白的氨基酸組成與哺乳動物膠原蛋白類似，其中甘氨酸是最豐富的氨基酸，占所有氨基酸的30%以上。然而在海洋源性膠原蛋白中，特別是在冷水魚膠原蛋白中，亞氨基酸(包括脯氨酸和羥脯氨酸)的含量低于哺乳動物膠原蛋白的含量，但其含有更多的絲氨酸和蘇氨酸殘基[27]。這些氨基酸組成的差異，特別是羥基脯氨酸含量的差異，會導致膠原蛋白性質(zhì)的變化，表現(xiàn)在剛度、熱穩(wěn)定性和變性溫度的變化中，而更高含量的亞氨基酸會使膠原蛋白的穩(wěn)定性增加[28]。

2.2 熱穩(wěn)定性

膠原中，羥脯氨酸和羥賴氨酸的羥基通過鏈間氫鍵結合到羰基基團上，從而增加了膠原三螺旋的熱穩(wěn)定性。因此，脯氨酸和賴氨酸的含量直接影響膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。海洋源性膠原蛋白的亞氨基酸含量較低，因而其變性溫度低于哺乳動物膠原蛋白的變性溫度。同時，生活在寒冷環(huán)境中的魚類(例如鮭魚)所產(chǎn)生的膠原蛋白的羥脯氨酸含量較低(35%～37%)，與生活在溫暖環(huán)境中的魚類(例如羅非魚膠原蛋白的羥脯氨酸含量約為43%)相比，其膠原蛋白的熱穩(wěn)定性也較低[29]。因此，魚膠原蛋白的亞氨基酸含量與其熱穩(wěn)定性相關，并與它們正常棲息地的水溫相關。

另外，由于海洋源性膠原蛋白的變性溫度低于哺乳動物的體溫，因此放置在高于37 ℃下海洋源性膠原蛋白會發(fā)生融化現(xiàn)象。源自溫水魚類(包括羅非魚)的膠原蛋白可以表現(xiàn)出與哺乳動物膠原蛋白相似的氨基酸組成、流變特性和熱穩(wěn)定性[30]，這提示溫水魚類膠原蛋白有望作為哺乳動物膠原蛋白的替代品而用于生物醫(yī)學中。

與陸地脊椎動物膠原蛋白相比，較低的變性溫度和黏度也阻礙了海洋源性膠原蛋白作為生物材料應用于組織工程中，尤其是魚類來源膠原蛋白的支架的制備。目前這一問題已經(jīng)通過體外化學交聯(lián)穩(wěn)定膠原蛋白，實現(xiàn)了對膠原原纖維形成的改善。用于穩(wěn)定膠原蛋白的交聯(lián)方法可分為物理處理(例如使用UV輻照、γ輻照或脫氫熱處理)和化學處理(例如使用戊二醛、碳二亞胺或1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)-碳二亞胺(EDC))[31]。盡管化學處理可導致其存在潛在的細胞毒性或較差的生物相容性，但化學處理可顯著提高膠原蛋白支架的強度和穩(wěn)定性，而物理處理僅可提供足夠的穩(wěn)定性，因此在組織工程中，化學處理被廣泛的應用于海洋源性膠原蛋白生物材料的制備中。

3 海洋膠原蛋白的提取與制備技術

按照不同的來源，對海洋源性膠原蛋白的提取有不同的方法，但從魚副產(chǎn)品和其他海洋資源中分離膠原蛋白的通用步驟一般包括準備、提取和回收。

3.1 膠原蛋白的分離準備

準備工作包括清潔、分離動物部位以及通過切割或切碎樣品來減小尺寸，為接下來的化學預處理做準備。對于鱈魚、鮭魚和大馬哈魚等魚類來說，因為各部分膠原蛋白組成不同，一般會對其皮膚、魚鱗、魚鰭和骨頭分別進行提取[19, 22, 24]。對于魷魚等軟體動物來說，一般采用機械方法將其皮膚與魷魚體分開[11]。對于水母來說，一般將其口腕與傘分開，然后再將傘分成中胚層、上傘和下傘后進行提取[9-10]。

準備工作還包括化學預處理，通常使用氫氧化鈉去除非膠原蛋白、色素或脂肪成分，該預處理方法不會對膠原鏈造成結構改變。但是，去除鱈魚皮膚上的非膠原蛋白時，使用氯化鈉替代氫氧化鈉[19]。另外，為了從骨、軟骨和鱗中脫礦質(zhì)，可以使用乙二胺四乙酸(EDTA)或稀鹽酸進行預處理[32]。

3.2 膠原蛋白的提取

對于提取階段，由于膠原蛋白的三重螺旋結構存在強交聯(lián)，因此它在冷水中的溶解度很差。目前有2種常規(guī)的提取方法：酸增溶的膠原蛋白的提取和胃蛋白酶增溶的膠原蛋白的提取。使用這2種方法提取的膠原蛋白的產(chǎn)量、化學組成和特性互不相同。

當僅使用酸進行膠原蛋白提取時，該產(chǎn)品稱為酸溶性膠原蛋白。為了從海洋動物組織中提取膠原蛋白，最常使用的是終濃度0.5 mol/L的乙酸，但也使用檸檬酸和乳酸。大約95%的海洋無脊椎動物(例如水母)由水組成，這會影響膠原蛋白在乙酸中的溶解度[9-10]。因此，為了改善膠原蛋白在稀酸中的溶解度增加提取產(chǎn)量，必須將水母進行勻漿或冷凍干燥。另外利用酸處理聯(lián)合調(diào)節(jié)pH值以及超聲等物理處理的方式時，與常規(guī)提取工藝相比，提取產(chǎn)量可以顯著提高[33]。

在提取過程中添加胃蛋白酶提取的膠原蛋白稱為胃蛋白酶可溶性膠原蛋白。這種處理非常有效，因為蛋白酶可在不破壞三螺旋結構完整性的情況下切割端肽交聯(lián)的區(qū)域，從而水解某些非膠原蛋白并增加膠原蛋白的純度[34]。但是，長時間使用大量胃蛋白酶可能會導致膠原蛋白裂解，損害三螺旋結構的完整性，從而導致膠原蛋白產(chǎn)量的降低。

3.3 膠原蛋白的回收

在回收步驟中，通常通過添加終濃度2.3～2.6 mol/L的氯化鈉溶液沉淀膠原蛋白。通過離心收集所得沉淀物，將其溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，透析并冷凍干燥即可得到膠原蛋白。其中水母膠原蛋白的回收可以通過在0.5 mol/L的乙酸溶液中增溶3 d，然后利用Na2HPO4溶液進行透析。沉淀的膠原通過離心再添加固體氯化鈉進行分離，最后溶解于乙酸并通過再沉淀得到。也可以用胃蛋白酶消化以獲得膠原[33]。魚鱗的處理方法也可以參照上述步驟[23]。

海膽的膠原蛋白不同于其他膠原，不能通過傳統(tǒng)的水解膠狀物的酸增溶方法來提取。因此，在海膽膠原蛋白的提取中，需先將天然組織切碎，繼而依次利用低滲溶液和SDS-脫細胞溶液處理以除去細胞碎片、骨骼和色素，然后將其加到β-巰基乙醇溶液中放置3～4 d后，通過過濾并在0.5 mol/L EDTA-Na溶液中透析獲得膠原蛋白。使用相同的方案可以從海星腕臂中提取到膠原蛋白，但是在脫細胞后，樣品需要增加額外的步驟以去除新鮮組織中存在的碳酸鈣小骨[35]。

4 海洋膠原蛋白在組織工程生物材料中的應用

組織工程學是生命科學領域中一個新興且迅速發(fā)展的跨學科領域，它利用工程學和生物學原理將細胞與支架有機結合，從而促進受損或患病組織或器官的再生。其中，支架是由多種生物材料制成的3D結構，是細胞附著和維持生長的重要支撐載體。生物材料大分子的化學組成、結構和排列方式?jīng)Q定了支架的機械性能和生物學特性，并進而影響附著細胞的形態(tài)、行為和功能。

在選擇適合于組織工程應用的生物材料時，應考慮多種關鍵因素，包括：(1)生物材料的來源；(2)適合細胞生存的機械特性；(3)最佳的生物相容性，以促進細胞貼附、增殖和分化；(4)適合于各種形狀和尺寸的制造方法。

應該選擇合適的生物材料來制造支架。在可用的生物材料類型中，合成聚合物因其良好的加工特性而被廣泛用于支架的制備，缺點在于其具有疏水性因而缺少細胞結合位點進而無法很好的為細胞提供附著。天然聚合物，包括多糖(透明質(zhì)酸、藻酸鹽、殼聚糖和纖維素等)和蛋白質(zhì)(膠原蛋白、明膠、纖維蛋白、絲素蛋白和角蛋白等)，由于其高生物相容性，可以出色的促進細胞黏附和生長，因而可以作為理想的生物材料用于支架的制備。然而，天然聚合物通常不具有良好的機械性能，并且熱穩(wěn)定性較合成聚合物低，因而需要化學改性或復合制備才能滿足支架的制備要求。海洋源性膠原蛋白通過化學改性或復合制備后表現(xiàn)出較陸生動物膠原蛋白更好的熱穩(wěn)定性及機械性能，提示其可能成為組織工程最有前途的生物材料[36](見圖1)。

圖1 海洋源性膠原蛋白作為支架在組織工程領域的應用[36]

4.1 海洋膠原蛋白在骨和軟骨組織工程及再生中的應用

骨再生是一個復雜的骨形成過程，不但可以在正常的骨折愈合過程中觀察到，且在整個成年生活中都有持續(xù)的骨再生。但是，在個別復雜的臨床情況下，需要大量的骨再生，例如由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤切除或骨骼異常引起的缺損和損傷而導致的大骨骼重建、再生過程中骨受損，包括無血管性骨壞死、萎縮性骨不連和骨質(zhì)疏松等。目前，有很多不同的策略可以修復受損的骨或幫助骨再生，包括“金標準”自體骨移植、游離腓骨血管化移植、同種異體移植、骨傳導性支架及骨祖細胞移植等。以生產(chǎn)具有生物力學特性的組織工程骨移植替代物正成為最有效的治療方式，其中大量海洋源性膠原蛋白已經(jīng)用于組織工程中，如骨組織和軟骨組織的體外構建。

從羅非魚鱗片中提取的水解魚膠原蛋白可以誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化，其中水解魚膠原蛋白不僅可以提高細胞活力，還可以顯著上調(diào)成骨標志物和內(nèi)皮標志物的表達，這表明水解魚膠原蛋白具有促進細胞向成骨和內(nèi)皮細胞分化的作用[37]；從鱈魚的骨骼和皮膚中提取的魚膠原蛋白可以促進人成骨細胞的增殖及成骨標記物的表達，提高骨特異性堿性磷酸酶活性和礦化速度[38]；用鱈魚和鰈魚膠原蛋白處理的成骨細胞MC3T3-E1中膠原蛋白修飾酶的基因表達顯著上調(diào)，并且在培養(yǎng)物中產(chǎn)生更多的膠原蛋白沉積。與對照組相比，膠原蛋白表現(xiàn)出更大程度的賴氨酸羥化、更高水平的羥賴氨酸-醛衍生的交聯(lián)和更快速度的基質(zhì)礦化[39]。這些結果暗示魚膠原蛋白具有顯著促成骨細胞分化的活性，有望作為組織工程骨的生物材料。

已有研究報道了來自鮭魚皮膚的膠原蛋白對成年大鼠股骨發(fā)育的影響[40]。來自這項研究的數(shù)據(jù)進一步說明海洋源性膠原蛋白不僅增加了血清骨鈣素和堿性磷酸酶的含量，而且還增加了實驗動物生長中股骨的大小、礦物質(zhì)密度以及股骨的剛度和韌性，這表明這種膠原蛋白可以促進成年雄性大鼠長骨的發(fā)育。

因而基于上述膠原蛋白的特性，目前已有大量研究提出了通過模仿天然骨組織微環(huán)境，體外構建基于膠原蛋白的組織工程支架，從而加速骨組織的再生。如通過優(yōu)化的冷凍干燥方法，使用來源于鯊魚皮的膠原蛋白和鯊魚牙齒的磷灰石，制備了膠原蛋白/磷灰石復合支架，用于硬組織的體外構建[41]。這種膠原蛋白/磷灰石復合支架有效地提高了人類骨肉瘤細胞的活力，表明其有望用于骨再生治療。

以相同的方式，使用藍鯊的Ⅱ型膠原蛋白通過凍干開發(fā)了膠原蛋白/羥磷灰石/殼聚糖復合海綿，可以用于組織工程軟骨的體外構建，結果發(fā)現(xiàn)這種用羥磷灰石礦化的基于膠原蛋白/羥磷灰石的復合海綿有效地促進了成骨細胞的增殖活性并顯著提高了成骨細胞堿性磷酸酶的活性，表明其可以作為替代哺乳動物膠原蛋白的組織工程軟骨應用的合適生物材料[42]。礦化的鮭魚膠原蛋白、藻酸鹽和原纖維化的水母膠原蛋白經(jīng)冷凍干燥和交聯(lián)制備，從而開發(fā)出新型的基于膠原蛋白纖維的堅韌雙網(wǎng)絡復合水凝膠。這種支架能夠促進骨髓源性人的間充質(zhì)基質(zhì)細胞的軟骨形成和成骨分化，同時，植入兔缺損軟骨模型4周后，該支架在體內(nèi)表現(xiàn)出出色的生物力學性能，暗示了其應用于體外軟骨構建的潛能[43]。另外從水母中提取的膠原蛋白用冷凍干燥法制成的膠原支架，可以使人和大鼠鼻中隔軟骨細胞在其上正常生長，并促進細胞分泌軟骨基質(zhì)蛋白。在這項研究中，基于水母膠原蛋白的支架能夠預防大鼠模型中的間隔穿孔，表明該膠原蛋白支架可以用于鼻軟骨修復[44]。再者，由原纖維化水母膠原蛋白和藻酸鹽構建的水凝膠混合支架可以增加人的間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化[45]。臨床研究也證明，海洋源性膠原蛋白有效促進骨關節(jié)炎患者的軟骨基質(zhì)合成并減輕其疼痛，上述結果提示，海洋源性膠原蛋白有望治療人骨關節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥，并幫助骨再生，因此，被用作組織工程的潛力候選生物材料[46]。

如今海洋源性膠原蛋白在骨及軟骨再生中展現(xiàn)出了巨大的潛力，且利用交聯(lián)及復合高強度物質(zhì)聯(lián)合制備的方式有效改善了這類材料無法應用于硬組織重建的不足，然而目前尚未有標準的可用來參考的交聯(lián)方法可以穩(wěn)定制備出力學性能方面與天然骨相匹配的膠原蛋白支架。此外，身體組織通常是具有彈性的，這種彈性會直接影響或調(diào)控細胞的行為，包括成骨分化和礦化基質(zhì)沉積等。因而如何在增強支架的硬度的同時兼顧支架的彈性，可能是未來需要研究的重點和難點。

4.2 海洋膠原蛋白在皮膚組織工程和皮膚修復中的應用

幾個世紀以來，由燒傷、創(chuàng)傷、感染、移植排斥、疤痕、遺傳缺陷和其他疾病的廣泛存在，人們對皮膚缺陷替代品的需求日益旺盛。通常情況下，正常的傷口愈合過程可分為3個階段，分別是：(1)止血和炎癥反應階段；(2)細胞增殖分化階段；(3)組織重建或瘢痕形成階段。理想的皮膚替代品要求其組織相容性好、植入或覆蓋創(chuàng)面不與機體發(fā)生不良反應且能治療或代替機體中的缺損組織，促進創(chuàng)傷愈合和修復。其中，利用膠原蛋白制備的組織工程皮膚修復物已取得顯著的研究進展，同時也已有大量團隊開展了對利用海洋源性膠原蛋白制備組織工程皮膚的研究[5, 17, 22]。

通過氨解將羅非魚的魚鱗膠原蛋白摻入P(3HB-co-4HB)共聚物中，能讓L929小鼠成纖維細胞更好地在復合支架上附著、生長和增殖。體內(nèi)研究表明，P(3HB-co-4HB)中加入1.5%的魚鱗膠原蛋白還可對傷口收縮有顯著影響， 7 d內(nèi)達到最高的傷口閉合率(61%)，表明該魚膠原蛋白支架可以用于皮膚傷口愈合[47]。

從印度鯪魚鱗片中分離的Ⅰ型膠原蛋白可作為蛋白支架支持人類原代成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞的有效生長和增殖，在該支架上將成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞進行三維共培養(yǎng)后，可加快傷口愈合速度并在體外形成分層的表皮層結構，證明其可作為皮膚替代品進行使用[48]。

利用電紡絲技術制備的魚膠原蛋白/生物活性玻璃(Col/BG)納米纖維，除拉伸強度得到有效改善外，并具有對金黃色葡萄球菌的抗菌活性，用作皮膚傷口敷料可有效防止病菌感染。另外Col/BG納米纖維不僅可以促進人類角質(zhì)形成細胞的黏附、增殖和遷移，還可以促進細胞中Ⅰ型膠原和血管內(nèi)皮生長因子的分泌，從而進一步刺激了人血管內(nèi)皮細胞的增殖。大鼠傷口模型結果表明，Col/BG納米纖維可以有效地誘導傷口區(qū)域的皮膚再生，說明其具有被用作傷口敷料的巨大潛力[49]。

從海洋海綿中分離出的膠原蛋白能刺激小鼠巨噬細胞、小鼠成纖維細胞和人角質(zhì)形成細胞的細胞存活和增殖，證明其具有顯著的抗氧化活性并保護細胞免受紫外線誘導凋亡，表明該種海洋源性膠原蛋白具有促傷口愈合和光保護特性，可用于修復受損或光老化的皮膚[50]。

4.3 海洋膠原蛋白在血管組織工程中的應用

由于各種疾病(包括心血管疾病、外周血管疾病和局部缺血)而需要替代血管的患者數(shù)量不斷增加，因此不僅迫切需要理解和掌握脈管系統(tǒng)發(fā)育和分化的機制，而且還需要能夠體外制備血管移植物或人造血管和淋巴管的能力。在過去的10年中，血管組織工程領域取得了長足的進步。這其中，海洋源性膠原蛋白已被接受并證明是血管組織工程的有效替代支架材料，廣泛應用于多種生物醫(yī)學領域。如有研究使用甲基化修飾和1，4-丁二醇二縮水甘油醚(BDE)交聯(lián)來改善魚鱗來源的膠原蛋白的理化特性，在無生長因子的條件下，在鼠模型中觀察到了膠原蛋白支架良好地整合到周圍組織中，并具有良好的細胞、血管和淋巴管浸潤，驗證了魚鱗來源的膠原蛋白作為血管支架材料的潛在應用價值[51]。

通過冷凍干燥和靜電紡絲制成了來自水母膠原蛋白和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)的管狀支架，在脈沖灌注系統(tǒng)下使用膠原蛋白/ PLGA混合支架對兔原代平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞進行共培養(yǎng)后，可以有效促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，并且還能誘導類似于體內(nèi)的天然血管樣的細胞的定向排列，提示膠原蛋白/PLGA支架在組織工程血管移植中具有良好的應用前景[52]。然而不可忽視的是，雖然海洋源性膠原蛋白的免疫原性較陸生哺乳動物低，但血管系統(tǒng)仍有可能對利用其構建的血管移植物引起機體炎癥反應，因此在當前階段仍需不斷探索和改進海洋源性膠原蛋白在血管組織工程中的應用模式。

4.4 海洋膠原蛋白在牙組織工程中的應用

牙齒的結構是獨特的，軟組織和硬組織同時存在，包括3種硬組織(牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì))和1種軟組織(牙髓)。在過去的10年中，牙組織工程領域朝著修復式的新概念發(fā)展，取得了巨大進步。

從羅非魚鱗片分離出的Ⅰ型膠原蛋白可促進細胞的活力，增加細胞的附著力，提高堿性磷酸酶的活性，并在大鼠成牙本質(zhì)細胞樣細胞(MDPC-23)中上調(diào)骨唾液蛋白的基因表達，并加速基質(zhì)礦化，這表明魚膠原蛋白可以用于牙再生[53]。且魚膠原蛋白還能提高了人牙周膜細胞的活力，并通過激活ERK信號通路上調(diào)成骨標志物和成骨相關蛋白的表達，表明魚膠原蛋白是一種有前途的可供生物活性牙槽骨再生中使用的生物材料的成分[54]。

電紡絲技術制備的羅非魚魚膠原蛋白/生物活性玻璃/殼聚糖納米纖維膜對變形葡萄球菌具有一定程度的抗菌活性，并可增強人牙周膜細胞的細胞黏附性、細胞活力和成骨基因的表達。在犬中該支架還促進了牙周缺損犬模型的骨再生，證明了其在臨床上作為誘導牙周組織再生具有巨大的潛力[55]。

4.5 海洋膠原蛋白在角膜組織工程中的應用

角膜損傷是患者失明的主要原因之一，當無法使用其他治療方法矯正視力時，角膜移植是最佳的治療方法。然而，供體的老齡化及短缺嚴重制約了角膜移植手術的開展。盡管目前已將包括羊膜及脫細胞角膜基質(zhì)在內(nèi)的不同生物材料用作角膜修復材料，并發(fā)現(xiàn)它們具有出色的生物相容性，但基于膠原蛋白的組織工程角膜也已取得了重大突破，并表現(xiàn)出了卓越的特性。

如用脫細胞和脫鈣的魚鱗膠原蛋白作為人類供體角膜組織的替代物，在大鼠眼部植入后，顯示出良好的生物相容性、足夠的透光率、合理的光散射值以及可用于角膜移植的能力，表明魚膠原蛋白可用于角膜移植以應對供體角膜的短缺[56]。

通過冷凍干燥從魚鱗中合成的魚膠原支架顯示出良好的機械強度、更好的溶脹率和更強的微生物抵抗力，且能使角膜上皮細胞更好地生長、增殖和遷移，提示魚膠原可以作為角膜再生和移植的生物材料[57]。

最近的研究中，樊廷俊等[58]利用來自太平洋鱈魚的純化魚皮膠原體外構建出了三維魚類膠原支架，為其作為載體支架用于組織工程角膜的體外構建研究提供了可能。同時鑒于膠原蛋白對疤痕的修復作用，利用膠原蛋白作為支架可能對移植后的角膜基質(zhì)的傷口有促進愈合作用。基于膠原蛋白的生物材料構建的組織工程角膜不但可以用于供體的替代物，還可以用于角膜修復和疤痕的抑制，值得進一步深入研究。

4.6 海洋膠原蛋白在神經(jīng)組織工程中的應用

神經(jīng)系統(tǒng)是人體的重要組成部分，無論是受傷還是疾病造成的損害，都可能導致嚴重或潛在的致命后果。由于復雜的生理系統(tǒng)和有限的再生能力，恢復受損的神經(jīng)系統(tǒng)是一個巨大的挑戰(zhàn)，因此迫切需要針對患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者的治療策略進行創(chuàng)新，用組織工程化的神經(jīng)移植物替代周圍神經(jīng)自體移植物從一定程度上解決了缺乏神經(jīng)組織的問題。

有研究報道，利用EDC/NHS對來源于羅非魚的膠原蛋白進行化學交聯(lián)后，可以制備出與腦組織硬度相似的凝膠支架，且在神經(jīng)誘導的早期階段，剛度約為1 500 Pa的凝膠可促進人誘導多能干細胞向背皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的分化[59]。這些發(fā)現(xiàn)表明，模仿大腦僵硬的魚膠原蛋白凝膠具有確定終末神經(jīng)亞型的潛力，有望用于神經(jīng)再生。

甲基丙烯酸酯化是另外一種改善魚類膠原蛋白強度的有效手段。有研究表明，通過將甲基丙烯酸酯化和UV交聯(lián)可以顯著提高來源于紅鯛魚的膠原蛋白的機械性能，將體外負載NSC-34運動神經(jīng)元細胞的膠原蛋白生物墨水和骨骼成肌細胞的甲基丙烯酸化水凝膠生物墨水進行共軸3D打印后可以形成結構化的神經(jīng)肌肉接頭模型[31]。

雖然已有開展基于海洋膠原蛋白在組織工程神經(jīng)再生中應用的研究，然而后續(xù)依然存在大量需要深入解決的問題，包括如何將海洋膠原蛋白用于復合神經(jīng)細胞物的培養(yǎng)。另外與其他組織相比，大腦的細胞外基質(zhì)含有較高比例的糖胺聚糖以及較小比例的膠原蛋白和其他纖維蛋白，鑒于此，海洋膠原蛋白必須與其他多糖類材料進行復合制備，才有望成為理想的神經(jīng)元建模支架。

5 展望

在過去的幾十年中，海洋源性膠原蛋白因其天然來源豐富且與陸生動物膠原蛋白具有相似的結構，已成為一種有前途的生物醫(yī)學應用材料。此外，它具有生物相容性、生物降解性、抗微生物活性、功能性、水溶性、易提取性、安全性和低生產(chǎn)成本的優(yōu)點，使其成為了可廣泛應用于各種組織工程(包括骨、軟骨、皮膚、血管、牙齒和角膜組織再生)的生物材料。而且，海洋源性膠原蛋白的加工條件靈活，取自魚類加工業(yè)和漁業(yè)活動的周邊成分，大大加強了這些“廢料”的高值化應用。同時，其通過化學改性或復合制備后表現(xiàn)出的高熱穩(wěn)定性及優(yōu)異的機械性能，更是彌補了陸生動物膠原蛋白的諸多不足。盡管海洋源性膠原蛋白所制備支架影響機體結構和生物力學特性，以及其對細胞生長和分化的信號調(diào)控途徑仍然沒有完全查清楚，但毋庸置疑的是，海洋源性膠原蛋白作為一種可用于開發(fā)組織工程產(chǎn)品的生物材料必將具有廣闊的應用前景。