鄧增卓瑪,馬文明,周青平,迪力亞爾·莫合塔爾,侯 晨,唐思洪
(西南民族大學(xué)青藏高原研究院,四川 成都 610041)
根際是指受根系分泌物的影響,其土壤理化性質(zhì)和生物活性與原土體明顯不同,并且靠近植物根系的狹小土壤區(qū)域[1]。由于其獨特的微環(huán)境,為微生物的大量增殖創(chuàng)造了條件[2]。根際微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中極其重要的組成部分,參與土壤生態(tài)系統(tǒng)中生物化學(xué)循環(huán)和能量流動,包括碳、氮、磷和硫等養(yǎng)分的循環(huán)和土壤有機質(zhì)的分解[3]。并且根際微生物一直以來被認(rèn)為是植物的第二基因組,對植物的生長發(fā)育有著不可替代的作用。植物和根際微生物的互作被喻為“超級生物”[4],經(jīng)過長期協(xié)同進化,植物與根際微生物形成一種互惠互利的共生模式,植物根系分泌有機物質(zhì)為微生物提供能量,而微生物代謝并產(chǎn)生一些信號分子、植物激素或通過活化營養(yǎng)物質(zhì)促進植物生長發(fā)育[5]。近年來國內(nèi)外對植物和根際微生物之間互作關(guān)系的研究越來越多,涉及了植物與微生物共生,如植物與植物根際促生菌(PGPR)和菌根真菌互作。此類微生物通過抑制疾病[4,6]、增加營養(yǎng)利用率[7]和降低非生物脅迫[8-9]等提高植物生產(chǎn)力;還包括一些抑制植物生長的有害微生物的研究,如尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)造成植物根系部位生理活動的異常,植物吸收養(yǎng)分的能力下降,最后甚至造成全株死亡[10]。因此,了解植物-微生物之間的復(fù)雜關(guān)系,對生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境的改善和生產(chǎn)力的提高等具有重要意義。
文獻(xiàn)計量分析作為整理文獻(xiàn)脈絡(luò)的方法,對探索大數(shù)據(jù)平臺下的研究知識圖譜意義重大。引文空間(CiteSpace)是美籍華人學(xué)者陳超美博士于2004開發(fā)的一款主要用于分析科學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的信息可視化軟件,可以用來制作科學(xué)和技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展的知識圖譜,有效地幫助研究者更好地了解他們所從事的研究領(lǐng)域,還可以突出該領(lǐng)域發(fā)展過程中的一些重要文獻(xiàn)、熱點研究和前沿方向[11]。本文通過對國內(nèi)外根際微生物近10年的文獻(xiàn)進行分析,對關(guān)鍵詞進行聚類可知,發(fā)現(xiàn)植物和非生物因子對根際微生物的相互作用以及根際微生物研究方法是近10年土壤微生物領(lǐng)域中關(guān)注度較高的領(lǐng)域。因此,本文從植物和非生物因子對根際微生物的影響為切入點,闡述了植被類型、植被生長期、根系分泌物和非生物因子對根際微生物的影響以及根際微生物對植被的正負(fù)反饋作用,總結(jié)了微生物可培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)缺點,以期為根際微生物的研究提供理論依據(jù)。
本文以美國科學(xué)情報所的Web of Science數(shù)據(jù)庫核心集合和中國知網(wǎng)(CNKI)為數(shù)據(jù)來源。文獻(xiàn)檢索時間為2011~2021年,由于2021年文獻(xiàn)繼續(xù)入庫,所以截至?xí)r間為2021年4月13日,Web of Science中 檢 索 主 題 為:“rhizosphere microbes”或 “rhizosphere microorganism”,語言類型限定為“english”,文獻(xiàn)類型為“article”、 “review”,學(xué)科領(lǐng)域為“environmental science”、“soil science”、“ecology”和“microbiology”,并且過濾“book review”和“note”等類型的文獻(xiàn),得到英文文獻(xiàn)共2240篇。在CNKI以“根際微生物”為關(guān)鍵詞,經(jīng)過篩選,刪除與關(guān)鍵詞無關(guān)的文獻(xiàn),得到中文文獻(xiàn)共1702篇。
將CiteSpace V分析時間段設(shè)為2011~2021、跨度為一年、節(jié)點類型選擇關(guān)鍵詞,年被引頻次排名為50,其他參數(shù)默認(rèn),生成文獻(xiàn)共被引圖譜,并進行分析,其中通過對數(shù)似然比算法(LLR)(聚類標(biāo)簽詞提取算法之一)對共被引文獻(xiàn)的關(guān)鍵詞進行聚類,可得出共被引文獻(xiàn)聚類知識圖譜。
關(guān)鍵詞是一篇文章的核心,在學(xué)科領(lǐng)域出現(xiàn)的高頻關(guān)鍵詞往往被視為熱點研究領(lǐng)域。關(guān)鍵詞共現(xiàn)分析是CiteSpace的基本功能之一,它可以通過分析文獻(xiàn)中出現(xiàn)的關(guān)鍵詞來判斷文獻(xiàn)之間的關(guān)系,展示學(xué)科的研究結(jié)構(gòu)[12]。因此,關(guān)鍵詞的提取可以幫助我們了解當(dāng)前研究方向的熱點和趨勢。關(guān)鍵詞的聚類更注重反映聚類間的結(jié)構(gòu)特征,突出聚類之間的關(guān)鍵點和重要聯(lián)系[13],并且每個聚類中節(jié)點標(biāo)簽反映了其核心的研究內(nèi)容。由圖1和2可知,對關(guān)鍵詞聚類后,分別形成12和17個聚類標(biāo)簽,并且國內(nèi)外近10年根際微生物研究均以根際微生物(國內(nèi):#7、#9、#12;國際:#1、#3、#4、#5、#6、#11、#15、#16)、根際微生物與植被的相互作用(國內(nèi):#0、#1、#3、#5、#11;國際:#0、#9、#12、#14)較多。還有微生物研究方法(國內(nèi):#6;國際:#12)和環(huán)境因子(國內(nèi):#2、#8;國際:#2)也是近幾年的研究熱點。
圖1 國內(nèi)根際微生物關(guān)鍵詞聚類知識圖譜
圖2 國際根際微生物關(guān)鍵詞聚類知識圖譜
根際微生物是連接土壤-微生物-植物系統(tǒng)中最大的生命群體[14],它是指黏附在根際土壤顆粒中的微生物。在根際這個微生境中,植物根系的生理活動,使周圍土壤的物理和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變,豐富了土壤有機質(zhì),進而為微生物的大量增殖創(chuàng)造了條件[2]。微生物及其產(chǎn)物也以各種積極的、消極的和中性的方式與植物的根系相互作用,影響植物的生長發(fā)育,改變養(yǎng)分動態(tài),也改變植物對疾病和非生物脅迫的敏感性。
3.1.1 植被生長期對根際微生物的影響
根際微生物的數(shù)量受植被年齡(或生長階段)的影響,不同生長期其數(shù)量和密度存在著一定的差異。孫海明[15]對羊草(Leymus chinensis)草原根際土壤微生物進行研究,結(jié)果表明不同生長期的環(huán)境因子是影響根際細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量的主要因素,土壤溫度和含水量低,微生物生長速度緩慢,數(shù)量相對較少。隨著土壤溫度和水分含量的增加,根際細(xì)菌、放線菌和真菌逐漸進入生長期和繁殖期,數(shù)量逐漸增加。邱立友等[16]發(fā)現(xiàn),在烤煙的整個生長期中,根際微生物的數(shù)量在旺長期最多,成熟期和采收期次之,團棵期最少。這主要與烤煙根系的生長代謝活性和土壤溫度有關(guān)。曾齊等[17]研究發(fā)現(xiàn),隨著大豆[Glycine max(Linn.)Merr.]生育期的推進,土壤有機質(zhì)含量逐漸減少,微生物的生長繁殖受到抑制,因此,栽培大豆和野生大豆根際細(xì)菌的數(shù)量均在分枝期最多,結(jié)莢期時有所下降,到成熟期數(shù)量最少。不僅根際微生物的數(shù)量隨著植物生長階段發(fā)生變化,群落組成也隨之改變,大部分研究者認(rèn)為這與植物在不同生長階段根系分泌物組成與數(shù)量有關(guān)。例如,在幼苗期植物分泌糖類可以吸引大量微生物,而在后期,植物分泌更多的酚類物質(zhì)對微生物群落進行選擇,抑制了部分微生物的繁殖[18]。因此,根際微生物群落組成隨之發(fā)生變化。
3.1.2 植被類型對根際微生物的影響
不同植物甚至同一物種的不同基因型,通過不同的根系分泌物,進而影響植物根際微生物的招募過程[19],使得根際微生物的種群密度、數(shù)量和群落在不同的植物類型和基因型也有一定的差異。馬曉梅等[20]研究發(fā)現(xiàn),胡楊(Populus euphratica)和檉柳(Tamarix chinensis)在根際細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量上均存在明顯差異。王少昆等[21]研究發(fā)現(xiàn),不同的灌木對不同根際微生物的生長有不同的影響,細(xì)菌在冷蒿(Artemisia frigidaL.)和小紅柳(Salix microstachyaL.)的根際生長旺盛,放線菌在小紅柳和差巴嘎蒿(Artemisia halodendronL.)根系周圍數(shù)量較多,小葉錦雞兒(Caragana microphyllaL.)和差巴嘎蒿為真菌生長繁殖提供有利環(huán)境,從總體上,4種灌木都有較強的根際正效應(yīng)。外來物種的入侵,可以從另一個角度證明植物種類對根際微生物的影響。李國慶[22]種植外來物種加拿大一枝黃花(Solidago canadensisL.)后,發(fā)現(xiàn)其根際微生物中細(xì)菌群落的優(yōu)勢種群為放線菌綱(Actinobacteria)鏈霉菌屬(Streptomyces),而土著種的優(yōu)勢種群仍然是α-變形菌綱(Alphaproteobacteria),并且加拿大一枝黃花中鏈霉菌屬代謝過程產(chǎn)生的抗生素通過抑制其他菌群的生長,使細(xì)菌種群的多樣性明顯降低。Bouffaud等[23]研究表明,玉米(Zea maysLinn.)根際細(xì)菌群落組成受到玉米品種基因型的影響,且群落結(jié)構(gòu)的改變主要表現(xiàn)為某些β變形菌屬(Betaproteobacteria)和特定伯克氏菌屬(Burkholderia)的變化。Aira等[24]研究發(fā)現(xiàn),負(fù)責(zé)植物碳分配的2個基因(su1和sh2)使根系分泌物發(fā)生了變化,進而改變了玉米根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和活性,但是對其優(yōu)勢菌的生物量并沒有發(fā)生顯著變化。然而,也有研究表明植物對根際微生物群落結(jié)構(gòu)影響不顯著。Singh等[25]在同一地點的土壤中種植3種禾草,以確定植物特異性對根際微生物群落的影響,發(fā)現(xiàn)不同植物根際土壤細(xì)菌群落組成具有相似性,表明植物種類對根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較小。付合才[26]以4種暖溫帶典型落葉櫟林的優(yōu)勢種和建群植物為研究對象,發(fā)現(xiàn)不同櫟屬植物的根際細(xì)菌群落組成和豐度差異也并不顯著。
3.1.3 根系分泌物對土壤微生物的影響
根系分泌物是指在植物的生長過程中,植物不同的根系部位通過各種方式釋放到土壤中的復(fù)雜有機物質(zhì)的總稱[27]。主要來源于健康的植物組織釋放和殘根等衰老組織的分解2個方面,包括由根細(xì)胞擴散產(chǎn)生的低分子有機質(zhì)、根系代謝形成的分泌物、根系脫落形成的高分子黏膠質(zhì)以及殘體的分解物4大類[28]。根系分泌的各種初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物,能夠通過塑造、傳遞信號或干擾等作用來影響根際微生物區(qū)系[29]。如黃芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)根系分泌物(茉莉酸和水楊酸)通過誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng),從而調(diào)節(jié)微生物群落[30]。苜蓿(Medicago sativa)可以產(chǎn)生一系列特殊的三萜,指導(dǎo)特定微生物群的組裝和維護,使其能夠根據(jù)自身的目的塑造和調(diào)節(jié)其根內(nèi)和根系周圍的微生物群落[31]。研究者還發(fā)現(xiàn),豆科植物通過分泌黃酮類化合物(2-phenyl-1,4-benzopyrone derivatives)與根瘤菌(Rhizobium)進行信號交流,這類物質(zhì)在根瘤菌激活蛋白的作用下,能誘導(dǎo)結(jié)瘤基因的表達(dá)[32],從而形成根節(jié)瘤,根節(jié)瘤為根瘤菌的繁殖提供了活動場所和營養(yǎng)物質(zhì)。除此之外,植物根系還可以通過分泌碳水化合物和氨基酸等來誘導(dǎo)PGPR的定殖。Rudrappa等[33]等研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)擬南芥(Arabidopsis thaliana)葉面病原菌侵染根際時,根系分泌物中釋放的蘋果酸可招募PGPR枯草芽孢桿菌在根際的定殖。進一步研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌通過激活擬南芥中的脫落酸和水楊酸信號通路,導(dǎo)致氣孔關(guān)閉,從而限制病原體入侵。植物根尖向根際釋放的緣細(xì)胞和黏液中含有大量的阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs),這些AGPs能夠不僅吸引有益微生物(細(xì)菌和真菌),而且還對植物根際病原菌具有一定排斥作用[34]。
土壤環(huán)境作為微生物的棲息地,對微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性有著重要的影響。非生物因素土壤養(yǎng)分、pH、含水量、溫度等都被認(rèn)為是影響根際微生物群落組成的重要因子。土壤養(yǎng)分及其生物有效性對根際微生物的多樣性和豐度有直接和間接(通過植物)的影響[35]。如熊藝等[36]對小麥根箱試驗的研究表明,缺氮使小麥根系分泌有機物質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量發(fā)生變化,抑制了硝化螺旋菌門(Nitrospirae)等氨氧化微生物的繁殖,但增加了富營養(yǎng)菌厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度。另一種重要的土壤養(yǎng)分磷,也是根際微生物群的調(diào)節(jié)因子。Beauregard等[37]利用磷脂脂肪酸和變性梯度凝膠電泳分析了施磷8年對單一栽培紫花苜蓿土壤微生物多樣性的影響。結(jié)果表明,施磷改變了真菌和細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu),但對物種豐富度沒有影響。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,農(nóng)作物生產(chǎn)力的主要制約因素之一是土壤養(yǎng)分的貧瘠,這主要取決于3種大量元素氮、碳和磷的含量。一般土壤營養(yǎng)的缺乏可以通過施肥來緩解。施用有機肥可以提高幼苗生物量,顯著提高土壤微生物和土壤酶活性[38]。有機肥可以塑造茶葉根際微生物組成,使根際有益細(xì)菌包括伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)和鏈霉菌目(Streptomycetales)的數(shù)量增加[39]。而長期施用化肥會導(dǎo)致嚴(yán)重的土壤酸化、營養(yǎng)失衡和根際微生態(tài)環(huán)境惡化,進一步增加土壤重金屬離子的活性,影響根際微生物的數(shù)量。Li等[40]對玉米農(nóng)田的研究表明,高氮肥量(N 312 kg·hm-2)的輸入導(dǎo)致土壤pH大幅下降,從而加劇了土壤酸化,導(dǎo)致根際周圍的環(huán)境不利于細(xì)菌生長,使得根際細(xì)菌多樣性普遍較低。pH也是影響細(xì)菌多樣性的關(guān)鍵因素。pH接近中性的土壤細(xì)菌群落多樣性最高,因為當(dāng)pH偏低或偏高時,細(xì)菌的代謝活性和增長率受到影響,當(dāng)一種微生物增長率下降到25%時,由于種間競爭的存在,會使其滅絕[41]。土壤pH還會間接通過影響?zhàn)B分有效性以及根系分泌物量和組成,間接影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。在干旱環(huán)境中,細(xì)菌多樣性被認(rèn)為受到溫度的變化、紫外線輻射的升高、低營養(yǎng)元素含量和低土壤水分含量的影響[42]。干旱使植物根際促生長細(xì)菌放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)的含量增加,兩者都與促進植物的生長有關(guān)[43]。根際的溫度主要影響不同微生物的生長速度。如Pietikainen等[44]發(fā)現(xiàn),無論何種土壤類型,真菌和細(xì)菌在25~30℃之間生長速度最快,在30℃以上,細(xì)菌相對于真菌的生長速度較快,而細(xì)菌則受較低溫度的影響更大,根際真菌與細(xì)菌的比值在低溫時升高,在溫度升高時則降低。
根際中存在著大量對植物有益和有害的根際微生物(表1)。植物根際有益微生物主要通過其各種生命活動促進植物的健康生長。如植物PGPR和菌根真菌等。根際有害微生物(DRMO)是指微效病原菌范圍內(nèi),靠其生物代謝而非寄生來抑制植物生長發(fā)育的一類根際微生物[45],包括有害根際細(xì)菌(DRB)和有害根際真菌(DRF)。然而,在根際細(xì)菌分類上,無論是DRB 或PGPR還沒有明確的界定。
3.3.1 植物根際促生菌
植物PGPR是植物根際一類重要的微生物,通常與根表面作用,通過酸化或螯合等作用增強礦物質(zhì)營養(yǎng)的吸收、細(xì)菌代謝產(chǎn)生植物激素、誘導(dǎo)植物抗性系統(tǒng)和產(chǎn)生抗生素來抑制病害等多種機制促進植物生長[73]。PGPR能將土壤中難溶性礦物質(zhì)分解并將其轉(zhuǎn)化為易于被植物吸收的化合物,從而有助于保護植物免受營養(yǎng)脅迫。如土壤中磷元素以不可溶的形式存在,在根際中磷酸鹽溶解細(xì)菌分泌的有機酸和磷酸酶改變磷的溶解性,促進植物吸收。甚至一些促生菌能夠?qū)⑼饨绛h(huán)境中的氮轉(zhuǎn)化為有機氮,供給宿主植物吸收利用。植物PGPR產(chǎn)生的植物激素包括生長素(IAA)、赤霉素(GAs)和細(xì)胞分裂素(CTK)等[74]。研究表明,植物根系獲得根際周圍促生菌合成的外援吲哚 3-乙酸(IAA),從而能夠促進根系的生長和分枝[75]。IAA還可以通過與質(zhì)膜上的質(zhì)子泵結(jié)合而被激活,改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,從而使細(xì)胞壁糖溶解,增加細(xì)胞的可塑性,進而增大細(xì)胞體積和促進RNA蛋白質(zhì)的合成,以達(dá)到促生作用[76]。CTK通過促進細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴大,影響側(cè)根和不定根的形成,因此對植物根系的形成和根系表面積的增加有一定的正向作用[77]。GAs是另一類植物激素,存在于從植物發(fā)芽到衰老的所有發(fā)育階段。然而,GAs最重要的生理效應(yīng)是促進芽的生長。PGPR對病原體的抑制主要通過產(chǎn)生抗生素和抗真菌代謝產(chǎn)物、溶解酶和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)[78]。例如,抗生素吩嗓酸和2,4—二乙酞藤黃酚是熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)最主要的2種次級代謝產(chǎn)物,對預(yù)防和治療小麥全蝕病菌Ggt所引起的小麥全蝕病有著重要作用[79]。在一些極端環(huán)境,如干旱、重金屬、鹽堿等脅迫下,PGPR能誘發(fā)植物抗性系統(tǒng)的反應(yīng),引起相關(guān)抗脅迫基因的表達(dá)上調(diào),從而減輕逆境對植物的傷害[80]。
3.3.2 菌根真菌
真菌與植物根系之間最常見的共生關(guān)系是菌根共生,而最常見的菌根真菌為叢枝菌根真菌(AMF)和外生菌根真菌(ECM)。叢枝菌根是農(nóng)業(yè)作物物種形成的菌根類型,菌根真菌經(jīng)過根皮層的生物營養(yǎng)定殖后,形成一種外部菌絲,它是連接根與周圍土壤微生境的橋梁[81]。叢枝菌根與保護植物免受生物脅迫有關(guān),如AMF通過與根系的病原真菌競爭入侵位點和營養(yǎng)物質(zhì),阻止病害相關(guān)蛋白的合成,從而提高寄主植物的抗病能力[82]。反過來,相關(guān)的真菌從宿主根中提取脂類和碳水化合物作為養(yǎng)分來源。還有研究表明,接種AMF能夠促進宿主植物對磷的吸收,改善植物體內(nèi)的磷營養(yǎng)缺乏狀況,進而促進植物的生長發(fā)育[83]。蔡曉布等[84]對草地植物穗序剪股穎(Agrostis hugoniana)和紫羊毛(Festucarubra)分別接種2種AMF,即根內(nèi)球囊霉(Glomus intraradices)和摩西球囊霉(Glomus mosseae),發(fā)現(xiàn)二者均能顯著促進植物根系對土壤中磷的吸收和利用。鹽漬化土壤環(huán)境會降低植物對水分的吸收,引起植物生理干旱,而AMF不僅可通過菌絲的生長擴大根系的吸收范圍,而且還能通過促進宿主植物根系生長,提高對水分的吸收速率,阻止寄主植物體內(nèi)的水分流失,減輕鹽脅迫造成的傷害[85]。外生菌根是真菌在植物根部皮層細(xì)胞間隙發(fā)育形成哈蒂氏網(wǎng)在根尖形成菌套結(jié)構(gòu)的共生體[86]。植物形成這種共生體后,可以提高對一些極端環(huán)境的耐受力。王琚鋼等[87]認(rèn)為,干旱脅迫下,ECM可以更好地利用30 cm以下的土壤水分,從而減緩干旱脅迫。ECM還可以保護寄主植物免受重金屬的毒害[88]。為了應(yīng)對這種毒性作用,生物擁有不同的防御機制,如減少攝取細(xì)胞外的金屬螯合劑,細(xì)胞內(nèi)的金屬螯合配體如谷胱甘肽的細(xì)胞溶質(zhì)、金屬硫蛋白和分割液泡[89]。特定螯合劑的合成和隨后的金屬配合物的螯合對于限制游離金屬濃度具有重要意義。
表1 根際微生物的生態(tài)功能
有害根際細(xì)菌(DRB)以氰化物、植物激素、鐵團和植物毒素的形式排泄出多糖和其他化學(xué)物質(zhì),可對植物的代謝產(chǎn)生負(fù)面影響,具體表現(xiàn)在種子萌發(fā)減少、生長抑制、根系伸長減少、根系變形和/或變色,以及根系定植真菌的感染增加[90]。氰化氫的產(chǎn)生在根際假單胞菌中最為常見,從馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)和小麥根瘤菌中分離出的假單胞菌約有50%能在體外產(chǎn)生氰化氫[91]。氰化物可以抑制由細(xì)胞色素氧化酶呼吸介導(dǎo)的ATP產(chǎn)生。這種抑制導(dǎo)致線粒體內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氫氧化釋放的電子沿著耐氰呼吸途徑進入氧氣。因此,大量能量以熱量的形式損失,而不是用于ADP的磷酸化[92],減少了用于根系養(yǎng)分吸收的熱量。Loper等[93]發(fā)現(xiàn),當(dāng)接種在甜菜(Beta vulgarisL.)種子上時,2種腸桿菌的菌株產(chǎn)生了足夠數(shù)量的IAA以減少根系的伸長。
近幾十年來,盡管微生物研究技術(shù)一直在不斷完善,大部分微生物由于在自然界的豐度較低、微生物之間復(fù)雜的合作關(guān)系、實驗室無法模擬特定的環(huán)境條件等導(dǎo)致難以分離和培養(yǎng),成了微生物中的暗物質(zhì)[94]。這些未培養(yǎng)的微生物在碳、氮和其他元素的循環(huán)以及對周圍的生物和環(huán)境有著重要影響。培養(yǎng)微生物的傳統(tǒng)方法側(cè)重于使用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基,創(chuàng)造有利于快速生長微生物的環(huán)境[95]。然而,營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基可能對那些在營養(yǎng)不良條件下生存的微生物有毒害作用。還有一些共生微生物在沒有輔助因子和輔助菌株的生長環(huán)境中無法進行生長。為了解決這些問題,科學(xué)家通過一些新的方法,如原培養(yǎng)、細(xì)胞分選技術(shù)和微流控芯片技術(shù)等克服傳統(tǒng)方法的缺點,用于培養(yǎng)以前未培養(yǎng)的微生物,以評估和監(jiān)測微生物生理活動和功能。在實驗室模擬微生物原生長環(huán)境的擴散室、擴散生物反應(yīng)器和分離芯片(iChip)等原位培養(yǎng)技術(shù),可以使生長因子擴散,但細(xì)胞不能擴散。在這種環(huán)境下,細(xì)胞可以從其自然環(huán)境或共生微生物處獲得必要的生長因子,同時進行隔離復(fù)制,形成理想的菌落[96]。此外,被分離的微生物產(chǎn)生的潛在生長抑制代謝物可以自由擴散,而不是在局部積累。以這種方式模擬原生長環(huán)境,避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)基過量營養(yǎng)物質(zhì)對某些物種的生長有害。雖然相對于傳統(tǒng)方法,原培養(yǎng)技術(shù)更有效地提高未培養(yǎng)微生物的數(shù)量,使得大量的稀有微生物得到培養(yǎng),但由于其可控性較差,會影響后續(xù)的分離效率。細(xì)胞分選技術(shù)包括光學(xué)鑷子和熒光活化細(xì)胞分選(FACS)等用于從混合群落的細(xì)胞懸液中分離單細(xì)胞,消除種間競爭,使得未培養(yǎng)微生物得到繁殖,進一步通過微生物和基因組之間的聯(lián)系揭示以前未發(fā)現(xiàn)的微生物功能[97]。FACS的原理是當(dāng)單個細(xì)胞有序地通過激光束時,目標(biāo)生物細(xì)胞中的熒光標(biāo)記被激發(fā),這些熒光信號代表了獨特生物標(biāo)記物,從而完成對細(xì)胞物理和生化特性的分析與分選。雖然,F(xiàn)ACS系統(tǒng)由于以單細(xì)胞為基礎(chǔ)分離目標(biāo)細(xì)胞,從而具有更高的分選精度。但是其復(fù)雜的分選機制使目前的FACS系統(tǒng)昂貴和笨重,而且在分選過程之前,在開放的環(huán)境中產(chǎn)生的氣溶膠會對環(huán)境造成潛在的污染。微流控芯片技術(shù)可以在多種基質(zhì)存在或不同物理化學(xué)條件下操作來自環(huán)境樣品的大量單個微生物?;瑒有酒?8]是將微生物分別接種在數(shù)千個微孔培養(yǎng)板中,這些微孔培養(yǎng)板可以包含各種介質(zhì)和基質(zhì),微生物繁殖成功后,將每個微孔培養(yǎng)板分成2個,形成2個相同的培養(yǎng)物。然后,在一個培養(yǎng)板的微生物可以被單獨篩選以進行生長和/或分類鑒定,而在另一個培養(yǎng)板中的微生物以繼續(xù)培養(yǎng)。微流控芯片技術(shù)能同時檢測到多種不可培養(yǎng)微生物的存在,分析速度快,還可以獲得目標(biāo)微生物的純培養(yǎng),為后續(xù)微生物生理生化特性的分析提供了條件。但是由于其在完全密封的室內(nèi)隔離培養(yǎng)單個微生物,許多依賴共生菌的代謝產(chǎn)物生長的微生物很可能無法成功培養(yǎng)。
根際微生物積極的參與植物根系-土壤復(fù)雜的相互作用中,并且對地上植物的生長、健康和適應(yīng)性至關(guān)重要。然而,我們?nèi)匀蝗狈﹃P(guān)于這個復(fù)雜相互作用中不同微生物參與的信息。因此,還需要通過測序等技術(shù)使我們能夠更有效地探索土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其基因,有助于更好地證明土壤微生物群落和功能的變化。進一步通過研究和比較微生物共生網(wǎng)絡(luò)來量化微生物共生模式,對研究其復(fù)雜的機理也顯得格外重要。
根際是國內(nèi)外的研究熱點,目前已經(jīng)從根際微生物、根系分泌物等方面進行了系統(tǒng)深入的研究。不同根系分泌物對某些土壤微生物具有招募作用,這類趨化性的細(xì)菌或真菌就能夠在根系周圍大量聚集和繁殖。如擬南芥根系分泌的三羧酸循環(huán)中間l-蘋果酸以劑量依賴的方式招募有益枯草芽孢桿菌FB17(Bacillus subtilisFB17)[33]。再如豆科植物誘導(dǎo)根瘤菌的繁殖和生長,而對有些病原菌的生長具有抑制作用。因此,植物根系分泌物如何具體調(diào)節(jié)土壤微生物,還需要從分子、生理和生態(tài)水平上進一步深入研究,以改善植物生產(chǎn)力。
盡管微生物研究技術(shù)一直在不斷完善,但是環(huán)境中仍存在大量無法分離和培養(yǎng)的微生物暗物質(zhì)。這些暗物質(zhì)可能代表了生命系統(tǒng)發(fā)育樹的主要進化線,并被認(rèn)為在生態(tài)系統(tǒng)的形成、進化和功能中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代方法都有優(yōu)缺點,將多種方法結(jié)合使其互補,有利于微生物暗物質(zhì)的分離和培養(yǎng)。如Liu等[99]將熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)與分離芯片(iChip)進行整合,用于水稻土壤微生物的研究,表明8個FACS-iChip平板共培養(yǎng)了19個屬近500株的菌株,但通過16S rRNA基因擴增,僅鑒定出6個屬。再如通過增加營養(yǎng)物質(zhì)濃度和熒光原位雜交鑒定與培養(yǎng)了納鹽古菌門(Nanohaloarchaeota)中第一個微生物[100]。因此,結(jié)合多種方法(常規(guī)培養(yǎng)方法、共培養(yǎng)、反基因組、高通量培養(yǎng)技術(shù)等)對微生物暗物質(zhì)進行多角度、大規(guī)模和綜合性的研究,以探索各種自然環(huán)境,特別是極端棲息地的微生物組,拓展我們對微生物的分類和功能多樣性的認(rèn)知。同時通過加強研究物種及功能之間的聯(lián)系,從而深入了解暗物質(zhì)的生理機制。