曾 玥，羅思晴，馬鑫喆，潘泓樂，劉紅梅，張鳴號，3

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；3.國家衛(wèi)健委代謝性心血管疾病研究重點實驗室，銀川 750004）

帕金森?。╬arkinson's disease，PD）是老年人群中一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的選擇性死亡導(dǎo)致紋狀體的多巴胺水平降低為特征[1]。PD的病因和發(fā)病機制尚不明確。研究[2]發(fā)現(xiàn)，氧化損傷和線粒體功能障礙在PD的發(fā)病機制中起著重要作用?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的增加可以觸發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的形成[3-4]。MPTP引起線粒體釋放促凋亡蛋白，包括細胞色素C（cytochrome C，cyto C）、caspase-9、Smac/DIABLO、核酸內(nèi)切酶G（EndoG）、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF），引起細胞內(nèi)鈣超載，最終導(dǎo)致細胞死亡[3-4]。AIF是一種進化保守的黃素蛋白，能夠誘導(dǎo)caspase非依賴性細胞凋亡。線粒體形態(tài)是由細胞器裂變和融合之間的平衡動態(tài)控制的[5]，而AIF缺乏可破壞這種動態(tài)平衡，從而導(dǎo)致線粒體損傷[6]。作為對促凋亡信號的反應(yīng)，AIF從線粒體易位到細胞核，并與DNA相互作用，刺激染色質(zhì)凝結(jié)和高分子量DNA碎片化[7]。因此推測，如能減少魚藤酮誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生、維持線粒體膜電位和抑制AIF產(chǎn)生，將對維持線粒體膜穩(wěn)定和細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，減少細胞死亡發(fā)揮重要作用。

環(huán)孢素A（cyclosporin A，CsA）是一種通過與Cyp-D結(jié)合抑制MPTP的免疫抑制劑，N-甲基-4-異亮氨酸環(huán)孢素（N-methyl-4-isoleucine-cyclosporin，NIM811）是一種CsA衍生物。在本實驗中，我們研究了NIM811對魚藤酮誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細胞死亡的體外影響，通過檢測ROS的產(chǎn)生、線粒體膜電位、線粒體cyto C的釋放、caspase-9的激活和AIF核易位，闡明NIM811通過抑制MPTP減輕AIF核易位和細胞凋亡的可能機制，為NIM811的神經(jīng)保護作用和PD的防治提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 資料

HT22細胞株由夏威夷大學(xué)Jun Panee博士提供；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS（GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT，USA），F(xiàn)BS、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素溶液（Thermo Fisher Scientific，USA）；NIM811（Zymes LLC，Hasbrouck Heights，NJ，USA）；魚藤酮（Sigma，USA）；Alamar Blue（Thermo Fisher Scientific，USA），二氫乙二胺（DHE）熒光探針、四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM）、Hoechst（Life Technologies，Grand Island，NY，USA）；亞細胞結(jié)構(gòu)胞核與胞漿蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒（Abcam，USA）；抗cyto C抗體（1∶1 000，Cell Signaling Technology，USA）；抗caspase-9抗體（1∶1 000，Abcam，USA）；抗AIF抗體（1∶500，Cell Signaling Technology，USA）；抗Bcl-2抗體（1∶1 000，Thermo Fisher Scientific，USA）；抗Bax抗體（1∶1 000，Thermo Fisher Scientific，USA）；抗GAPDH抗體（1∶1 000，Cell Signaling Technology，USA）；PVDF膜（Millipore，USA）。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM/F12的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HT22細胞，細胞置于5%CO2、37℃、相對濕度90%～95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，當(dāng)細胞密度達到80%～90%時傳代，使用第3～7代的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞模型的建立與分組

使用第3～7代的HT22細胞，分成control組、魚藤酮組、魚藤酮+NIM811組和NIM811組。魚藤酮組給予4.0μmol·L-1魚藤酮刺激24 h，魚藤酮+NIM811組在魚藤酮刺激前3 h給予400 nmol·L-1的NIM811，NIM811組給予400 nmol·L-1的NIM811，control組給予等量的培養(yǎng)基[8]。

1.4 Alamar Blue法檢測HT22細胞活性

用第3～7代的HT22細胞，按照1.5×104個/孔細胞的密度接種于96孔板，各組給予不同刺激。在實驗結(jié)束前3 h，每孔加入10μL Alamar Blue溶液，避光，37℃培養(yǎng)箱中孵育3 h，PHERAstar酶標儀（BMG Labtech，Ortenberg，Germany）分別在520 nm和570 nm的激發(fā)波長和發(fā)射波長下讀取熒光強度。

1.5 DHE熒光探針測定細胞內(nèi)ROS的含量

第3～7代的HT22細胞，按照1.5×104個/孔細胞的密度接種于96孔板（黑色底板），各組給予不同刺激。在實驗結(jié)束前30 min，每孔加入2.5μmol·L-1的DHE溶液100μL，避光，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS清洗3次，使用FluoroMax-4熒光光譜儀（HORIBA Jobin Yvon Inc，Edison，NJ，USA）在480 nm和590 nm的激發(fā)波長和發(fā)射波長下讀取熒光強度。

1.6 TMRM測定線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）

第3～7代的HT22細胞，按照1.5×104個/孔細胞的密度接種于96孔板，各組給予不同刺激。在實驗結(jié)束前30 min，每孔加入100μL的TMRM（100 nmol·L-1）和10μg·mL-1的Hoechst溶液，避光，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS清洗3次，使用PHERAstar酶標儀在590 nm和670 nm的激發(fā)波長和發(fā)射波長下讀取熒光強度。

1.7 Western blot檢測AIF、cyto C、caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白的表達

HT22細胞在各組干預(yù)因子刺激24 h后，按亞細胞結(jié)構(gòu)胞核與胞漿蛋白抽提試劑盒操作流程提取細胞胞漿蛋白和胞核蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），上樣，120 V恒壓凝膠電泳，PVDF（0.22μm）膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST液洗膜3次，加入一抗[anticyto c（1∶1 000）、anti-caspase-9（1∶1 000）、anti-AIF（1∶500）、anti-Bax（1:1 000）、anti-Bcl-2（1∶1 000）、anti-GAPDH（1∶1 000）］，4℃孵育過夜，PBST液洗膜后加入二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，4-氯-1-萘酚顯色，曝光檢測內(nèi)參和目的蛋白，使用Image Lab軟件對條帶進行相對定量分析，結(jié)果以目的蛋白的值與內(nèi)參值的比值表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Prism 6.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NIM811對魚藤酮誘導(dǎo)的HT22細胞毒性的保護作用

與control組相比，4.0μmol·L-1魚藤酮刺激24 h后，HT22細胞的活力降低到56.26%（P＜0.01）。細胞明顯縮小，核濃縮，細胞周圍形成透明圈，符合光學(xué)顯微鏡下凋亡細胞的典型特征，顯示魚藤酮誘導(dǎo)了HT22細胞凋亡。給予400 nmol·L-1的NIM811干預(yù)后，細胞活力從56.26%上升到83.37%，凋亡細胞數(shù)量較魚藤酮組減少（P＜0.05），見圖1。

圖1 NIM811對魚藤酮誘導(dǎo)的HT22細胞毒性的保護作用

2.2 NIM811對HT22細胞中ROS含量的影響

DHE可被超氧化物氧化形成乙二醛，并在產(chǎn)生超氧化物陰離子的位置沉淀。魚藤酮孵育HT22細胞24 h后，與control組比較，ROS增加了61%（P＜0.05）。400 nmol·L-1的NIM811預(yù)處理使ROS水平基本恢復(fù)正常（P＜0.05）。而單獨給予NIM811并沒有增加超氧化物的形成，見圖2。

圖2 NIM811對HT22細胞中ROS含量的影響

2.3 NIM811對MMP的影響

魚藤酮孵育后，HT22細胞MMP降低（P＜0.01）。400 nmol·L-1的NIM811預(yù)處理抑制了魚藤酮引起的MMP去極化，MMP升高（P＜0.01），見圖3。

圖3 NIM811對MMP的影響

2.4 NIM811阻斷了魚藤酮誘導(dǎo)的AIF核易位

與control組比較，魚藤酮刺激HT22細胞24 h后，核蛋白中的AIF水平增加（P＜0.01），用400 nmol·L-1的NIM811預(yù)處理魚藤酮孵育的HT22細胞，降低了細胞核中AIF的蛋白水平（P＜0.01），表明NIM811阻斷了AIF的核易位，見圖4。

圖4 NIM811對核蛋白中AIF表達的影響

2.5 NIM811對胞質(zhì)cyto C、caspase-9、Bax和Bcl-2的影響

與control組比較，魚藤酮刺激后胞質(zhì)中的cyto C、caspase-9和Bax蛋白表達增高（P均＜0.05），Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.01）。用400 nmol·L-1的NIM811預(yù)處理魚藤酮孵育的HT22細胞后，與魚藤酮組比較，cyto C、caspase-9和Bax蛋白表達降低，而Bcl-2蛋白表達升高（P均＜0.05），見圖5。

圖5 NIM811對胞質(zhì)cyto C、caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)4.0μmol·L-1魚藤酮可以誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細胞凋亡，CsA衍生物NIM811可以減輕魚藤酮誘導(dǎo)的HT22細胞凋亡，而單獨給予NIM811刺激對HT22細胞的活力沒有顯著影響。進一步證明NIM811的神經(jīng)保護作用與其降低ROS的產(chǎn)生，維持線粒體膜電位，抑制AIF核易位，減輕線粒體cyto C的釋放與caspase-9的激活相關(guān)。

魚藤酮是一種應(yīng)用廣泛的農(nóng)藥，多年來一直被用作在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)PD模型，并被證明具有可重復(fù)性[9-10]。魚藤酮可以抑制線粒體電子轉(zhuǎn)運鏈復(fù)合物Ⅰ，其神經(jīng)毒性可能與ROS的產(chǎn)生和干擾線粒體氧化磷酸化有關(guān)[11]。ROS水平升高導(dǎo)致線粒體膜去極化和AIF等促凋亡因子釋放，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[12-13]。

MPTP位于線粒體內(nèi)膜上，是調(diào)節(jié)線粒體生理功能的重要組成部分，參與調(diào)節(jié)鈣依賴的細胞信號傳導(dǎo)、基因表達的調(diào)節(jié)、細胞毒性ROS的合成和釋放、cyto C和其他凋亡細胞死亡因子的釋放[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，魚藤酮孵育的HT22細胞中ROS水平顯著升高，這與之前的報道[15]結(jié)果一致。ROS主要產(chǎn)生于線粒體內(nèi)膜呼吸鏈中的電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ中，線粒體受內(nèi)外環(huán)境因素刺激時，如射線、香煙煙霧、抗生素、高血糖、炎癥因子、高血脂、缺氧等，ROS的產(chǎn)生會增加[16]。ROS產(chǎn)生的增加可以觸發(fā)MPTP的形成。MPTP可導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化降低，細胞能量代謝障礙。作為線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑，魚藤酮可與電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ結(jié)合，阻礙電子從復(fù)合物Ⅰ向Ⅲ傳遞，從而促進超氧化物的生成[10-11]。顯示魚藤酮可能通過增強ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致線粒體功能障礙和細胞凋亡。

在本研究中，魚藤酮孵育后，HT22細胞MMP降低。400 nmol·L-1的NIM811預(yù)處理抑制了魚藤酮引起的MMP去極化，MMP升高。顯示魚藤酮刺激誘導(dǎo)了線粒體膜電位去極化，促進MPTP的形成，而NIM811可以抑制這一過程。線粒體是ROS的主要靶細胞器，ROS的大量產(chǎn)生可誘導(dǎo)線粒體MPTP的開放，釋放鈣離子、cyto C、AIF等，引起caspase-9激活。caspase-9作為經(jīng)典的促凋亡caspases，參與了線粒體信號通路細胞凋亡的啟動，并能激活caspase-3/6/7，后者參與了細胞凋亡過程的執(zhí)行。同時，ROS可誘導(dǎo)線粒體電子傳遞鏈解耦聯(lián)，下調(diào)腺嘌呤核苷三磷酸的產(chǎn)生，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達水平，最終使線粒體外膜破裂，導(dǎo)致細胞凋亡[17-18]。AIF通常位于線粒體雙層膜的間隙，在控制細胞存活和死亡方面具有雙重作用[19]。AIF在細胞質(zhì)中合成，然后輸入線粒體膜間空間，在那里它是維持線粒體形態(tài)和嵴結(jié)構(gòu)所必需的[20]。當(dāng)細胞受到內(nèi)外環(huán)境因素刺激時，AIF轉(zhuǎn)移到細胞核導(dǎo)致DNA和核膜損傷。在氧化應(yīng)激等病理情況下，AIF從線粒體釋放到細胞核，激活線粒體啟動的caspase非依賴性細胞死亡途徑，也稱為AIF介導(dǎo)的細胞凋亡[8，21-22]。在本研究中，我們觀察到魚藤酮孵育導(dǎo)致胞核中的AIF蛋白含量增加，線粒體膜電位顯著去極化，提示AIF可能是通過MPTP釋放的。說明魚藤酮激活了線粒體啟動的、caspase非依賴性細胞死亡途徑。進一步研究魚藤酮是否還激活caspase依賴的細胞死亡途徑，以及魚藤酮誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化及MPTP形成與HT22凋亡的關(guān)系，在魚藤酮孵育24 h后，檢測了細胞質(zhì)中的cyto C、caspase-9和細胞凋亡標志蛋白Bax和Bcl-2的蛋白表達。結(jié)果表明，胞質(zhì)蛋白中cyto C、caspase-9和Bax的蛋白質(zhì)含量增加，而Bcl-2的蛋白含量降低。提示魚藤酮刺激誘導(dǎo)了線粒體cyto C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，caspase-9被激活并引起HT22細胞凋亡，說明魚藤酮激活了caspase依賴的細胞凋亡途徑。

CsA是一種通過與Cyp-D結(jié)合抑制MPTP的免疫抑制劑。由于CsA的嚴重副作用和潛在毒性[23]，很難對其進行大劑量的檢測。實驗證據(jù)表明[24]，MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡是缺血性腦損傷的重要組成部分，特異性MPTP抑制劑CsA可減少腦缺血動物模型的神經(jīng)元死亡和梗死面積。研究[25]發(fā)現(xiàn)，在沙鼠缺血模型中再灌注早期給予CsA可以阻斷缺血誘導(dǎo)的線粒體cyto C的釋放（MPTP打開的標志），并減少海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失。NIM811是一種CsA衍生物，因其缺乏任何免疫抑制特性，毒性相對較小，可在比CsA更高的劑量下使用[26]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[27]，NIM811通過抑制魚藤酮誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體和細胞焦亡，在PD中發(fā)揮保護作用。在急性胰腺炎中，NIM811可以保護腺泡和導(dǎo)管細胞中的線粒體功能，并保存了胰腺導(dǎo)管細胞中的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運機制[28]。這些研究結(jié)果為NIM811和CsA通過抑制MPTP的形成表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用提供了強有力的證據(jù)。

綜上所述，給予NIM811預(yù)處理增強了HT22細胞活力，降低了ROS的產(chǎn)生，維持了線粒體膜電位，抑制了AIF核易位，減輕了線粒體cyto C的釋放和caspase-9的激活，抑制了HT22細胞凋亡。說明NIM811通過抑制ROS的產(chǎn)生，維持線粒體MMP，抑制MPTP的形成，減少線粒體cyto C的釋放和caspase-9的激活，減輕AIF核易位，從而減輕魚藤酮誘導(dǎo)的HT22細胞凋亡，對PD具有保護作用。