楊成賀 姜世豪 肖玉蘭

（1上海離草科技有限公司，上海 200240；2浙江清華長(zhǎng)三角研究院，嘉興 314006）

實(shí)踐表明，采用蘋(píng)果脫毒種苗進(jìn)行栽培生產(chǎn)，能有效增強(qiáng)蘋(píng)果樹(shù)的樹(shù)勢(shì)，提高蘋(píng)果樹(shù)的抗逆性，進(jìn)而提高蘋(píng)果的產(chǎn)量和品質(zhì)，故目前蘋(píng)果脫毒種苗的市場(chǎng)需求量巨大。但是，目前的蘋(píng)果脫毒種苗主要是依靠傳統(tǒng)的植物有糖組培技術(shù)來(lái)獲得的，且在蘋(píng)果脫毒種苗的有糖組培工廠化生產(chǎn)過(guò)程中，存在著植株生根慢、長(zhǎng)勢(shì)弱、緩苗期長(zhǎng)、成苗率不高等問(wèn)題，這些均制約了蘋(píng)果脫毒種苗的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。而大量研究表明[1-2]，相比傳統(tǒng)的植物有糖組培技術(shù)，應(yīng)用植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)（該技術(shù)又稱光自養(yǎng)微繁殖技術(shù)，是指容器中的小植株在人工光照條件下，通過(guò)吸收CO2進(jìn)行光合作用，以完全自養(yǎng)的方式進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖）進(jìn)行組培苗的繁育，能有效促進(jìn)組培苗的生長(zhǎng)和發(fā)育，大幅度降低組培污染率，明顯縮短整個(gè)生產(chǎn)周期。因此，有望在蘋(píng)果工廠化育苗中進(jìn)行植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)應(yīng)用。在此背景下，筆者進(jìn)行了植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)在蘋(píng)果工廠化育苗過(guò)程中的生根培養(yǎng)階段的應(yīng)用試驗(yàn)，并在陜西青美生物科技有限公司進(jìn)行了該技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用，以期促進(jìn)該技術(shù)在蘋(píng)果工廠化育苗中的應(yīng)用，及為該技術(shù)在其他作物上的應(yīng)用提供參考借鑒?，F(xiàn)將相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果和該技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用情況報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以蘋(píng)果矮化砧木品種M9T337增殖培養(yǎng)30 d的試管苗為材料，選取平均高度為3.04 cm、葉片數(shù)為9.6張、鮮重為108.4 mg、干重為13.5 mg的單株試管苗作為生根培養(yǎng)的接種材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理：（1）無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖。該處理采用上海離草科技有限公司開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的植物無(wú)糖培養(yǎng)系統(tǒng)（該系統(tǒng)由培養(yǎng)容器、空氣過(guò)濾裝置、自然換氣裝置和強(qiáng)制換氣裝置組成，相關(guān)設(shè)備安裝于培養(yǎng)室組培架上，培養(yǎng)室獨(dú)立配備CO2供給系統(tǒng)和補(bǔ)光燈）。接種容器是尺寸為28 cm（長(zhǎng))×22 cm（寬）×15 cm（高)的長(zhǎng)方形底無(wú)糖培養(yǎng)盒，每盒加入含水量為35%（重量比）的無(wú)菌蛭石350 g、無(wú)糖液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基，不加糖、瓊脂、激素和有機(jī)物，pH為5.8）800 mL，每盒接種蘋(píng)果試管苗150株，合計(jì)接種6盒，作為3次重復(fù)（每重復(fù)2盒）。培養(yǎng)時(shí)間為30 d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為100±18 μmol/（m2·s），光照時(shí)數(shù)為14 h/d，CO2濃度為 800～1 000 μmol/mol，培養(yǎng)室通氣時(shí)間與光照時(shí)間相同。（2)有糖培養(yǎng)微繁殖。該處理的培養(yǎng)基為1/2 MS+IAA 0.3 mg/L+瓊脂4.2 g/L+蔗糖30 g/L、pH 5.8，接種瓶為7 cm(直徑)×9 cm(高)的圓形底組培瓶，每瓶接種蘋(píng)果試管苗8株，合計(jì)接種114瓶，作為3次重復(fù)（每重復(fù)38瓶）。培養(yǎng)時(shí)間為40 d，培養(yǎng)光照強(qiáng)度為50±18μmol/(m2·s），其他培養(yǎng)條件與無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖處理相同。

1.3 調(diào)查項(xiàng)目及方法

分別在無(wú)糖培養(yǎng)30 d和有糖培養(yǎng)40 d后，每處理隨機(jī)抽取30株生根苗，測(cè)定生根苗的株高、單株葉片數(shù)、單株鮮重、單株干重和單株根數(shù)，隨后兩個(gè)處理的所有生根苗均轉(zhuǎn)移到溫室進(jìn)行煉苗和移栽，分別統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)方式的蘋(píng)果試管苗生長(zhǎng)情況

由表1可知，無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果試管苗的平均株高為7.68 cm、單株葉片數(shù)為14.8張、單株鮮重為720.1 mg、單株干重為81.4 mg，有糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果試管苗的平均株高為3.59 cm、單株葉片數(shù)為10.4張、單株鮮重為220.6 mg、單株干重為26.3 mg，無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果試管苗的株高、單株葉片數(shù)、單株鮮重、單株干重分別是有糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果試管苗的2.1倍、1.4倍、3.3倍、3.1倍，表明無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果試管苗的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于有糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果試管苗。同時(shí)，無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果試管苗的生根率為94.67%、平均單株根數(shù)為8.2條，且根部無(wú)愈傷組織，根系呈白色、粗壯，不同植株間根系的生長(zhǎng)發(fā)育差異較??；而有糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果試管苗的生根率為90.02%、平均單株根數(shù)為6.4條，根部有較為明顯的愈傷組織，根系呈淡黃色，不同植株間根系的發(fā)育差異較大。

表1 不同培養(yǎng)方式的蘋(píng)果試管苗生長(zhǎng)情況

2.2 不同培養(yǎng)方式的蘋(píng)果試管苗煉苗和移栽情況

由表2可知，無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果試管苗在生根培養(yǎng)30 d后，即可轉(zhuǎn)移到溫室進(jìn)行煉苗（即將培養(yǎng)容器開(kāi)蓋置于溫室中，使蘋(píng)果生根苗適應(yīng)外界環(huán)境），煉苗5 d后即可進(jìn)行移栽（即將蘋(píng)果生根苗帶蛭石直接從培養(yǎng)容器中栽種至育苗杯中，并澆透水），遮陽(yáng)緩苗處理3 d后即可除去遮陽(yáng)設(shè)施進(jìn)行蘋(píng)果種苗的正常管理，從蘋(píng)果試管苗生根培養(yǎng)到溫室種苗的正常管理，無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖處理合計(jì)需要38 d，且種苗移栽成活率高，達(dá)83.22%。有糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果試管苗在生根培養(yǎng)40 d后，才能轉(zhuǎn)移到溫室進(jìn)行煉苗（即將組培瓶置于溫室中，先不開(kāi)蓋過(guò)渡適應(yīng)7 d，再開(kāi)蓋緩苗處理7 d），煉苗14 d后進(jìn)行移栽（為保證移栽成活率，需先進(jìn)行生根苗根系上的瓊脂清洗處理工作，然后將生根苗栽種在育苗杯中，并澆透水），遮陽(yáng)緩苗處理7 d后才可進(jìn)行蘋(píng)果種苗的正常管理，從蘋(píng)果試管苗生根培養(yǎng)到溫室種苗的正常管理，有糖培養(yǎng)微繁殖處理需61 d，且種苗移栽成活率僅為58.83%，明顯低于無(wú)糖培養(yǎng)處理（表2）。

表2 不同培養(yǎng)方式的蘋(píng)果試管苗煉苗和移栽情況

3 植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)在蘋(píng)果工廠化育苗中的應(yīng)用實(shí)例

目前，上海離草科技有限公司開(kāi)發(fā)了可以直接用于蘋(píng)果脫毒種苗工廠化生產(chǎn)的植物無(wú)糖培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)經(jīng)陜西青美生物科技有限公司應(yīng)用（該公司當(dāng)前已投入使用的無(wú)糖培養(yǎng)室面積為300 m2），每月可生產(chǎn)蘋(píng)果無(wú)糖組培苗約52萬(wàn)株，相比于傳統(tǒng)的有糖組培技術(shù)，種苗數(shù)量提高了1.4倍，種苗繁育周期縮短了一半，種苗移栽成活率得到了保證，培養(yǎng)室單位面積利用率也有了一定程度的提高。見(jiàn)表3。

表3 無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)與有糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)的應(yīng)用對(duì)比

4 結(jié)論與討論

4.1 關(guān)于植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)在蘋(píng)果工廠化育苗中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

4.1.1 植株長(zhǎng)勢(shì)好

在傳統(tǒng)的植物有糖組培中，植物主要以糖為碳源，以異養(yǎng)的方式來(lái)獲取其植株生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分，而在植物組培過(guò)程中，培養(yǎng)基中的糖是造成污染的主要原因之一，故為了減少污染，在組培過(guò)程中，不得不使用封閉的、小的培養(yǎng)容器，以減少容器與外界的氣體交換，這就導(dǎo)致培養(yǎng)容器內(nèi)的環(huán)境條件不便于調(diào)控，植物生長(zhǎng)在透氣性差且高溫高濕的環(huán)境中，造成了其植株長(zhǎng)勢(shì)差、生長(zhǎng)發(fā)育不良甚至死亡。而采用植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)，植物的碳源來(lái)自于空氣中的CO2，培養(yǎng)基中不添加糖，可使用大空間的培養(yǎng)容器，這不僅大大減少了污染的發(fā)生，還便于培養(yǎng)容器內(nèi)部環(huán)境條件的調(diào)控[3]，使植物生長(zhǎng)在適宜的溫度和濕度下，且通過(guò)提高培養(yǎng)容器內(nèi)部的光照強(qiáng)度和CO2濃度，可以極大地促進(jìn)其植株的光合作用，使植株的干物質(zhì)積累和生長(zhǎng)發(fā)育速度加快，故最終培養(yǎng)出的種苗在植株長(zhǎng)勢(shì)方面表現(xiàn)較好，明顯優(yōu)于有糖培養(yǎng)苗[4]。例如，肖玉蘭等[5]比較了非洲菊的無(wú)糖培養(yǎng)苗和有糖培養(yǎng)苗，無(wú)糖培養(yǎng)苗的植株在長(zhǎng)勢(shì)和干物質(zhì)積累方面明顯優(yōu)于有糖培養(yǎng)苗；和世平[6]在進(jìn)行半夏無(wú)糖培養(yǎng)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，半夏無(wú)糖組培苗的株高顯著高于有糖組培苗。在本試驗(yàn)中，采用無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)培養(yǎng)出的蘋(píng)果種苗的植株長(zhǎng)勢(shì)也顯著優(yōu)于采用有糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)培養(yǎng)出的蘋(píng)果種苗，進(jìn)一步證實(shí)了植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)在木本植物組織培養(yǎng)上應(yīng)用具有一定的優(yōu)勢(shì)。

4.1.2 生根質(zhì)量高

傳統(tǒng)的植物有糖組培中常常使用凝膠狀的物質(zhì)（如瓊脂、卡拉膠等）作為生根培養(yǎng)基質(zhì)，這些培養(yǎng)基質(zhì)的透氣性極差，且在進(jìn)行滅菌后，其中的O2已完全散失，這不利于植株的根系生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育出的根系細(xì)弱，移栽時(shí)根系易受到損傷。而植物無(wú)糖培養(yǎng)可以采用多孔的無(wú)機(jī)物質(zhì)（如蛭石、珍珠巖、沙等）作為生根培養(yǎng)基質(zhì)，這些培養(yǎng)基質(zhì)有較高的空氣擴(kuò)散系數(shù)，透氣性較好，可大大改善植物的生根環(huán)境，有助于根系對(duì)養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而促使根系早生快發(fā)，且生長(zhǎng)發(fā)育良好[7]。在本試驗(yàn)中，采用無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)的蘋(píng)果試管苗的生根率比采用有糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)提高4.65%，生根質(zhì)量也明顯提高，這與本試驗(yàn)采用多孔的蛭石作為生根培養(yǎng)基質(zhì)有極大的關(guān)系。采用多孔的生根培養(yǎng)基質(zhì)有利于提高植物組培苗的生根質(zhì)量這一結(jié)論，在桉樹(shù)、甘薯、咖啡、山竹果等多種作物上均得到了驗(yàn)證[1]。例如，祁永瓊[8]在仙客來(lái)的無(wú)糖組培中，使用蛭石和珍珠巖作為生根培養(yǎng)基質(zhì)，與使用瓊脂作為生根培養(yǎng)基質(zhì)的有糖培養(yǎng)相比，無(wú)糖培養(yǎng)苗的根系發(fā)育和生根率均優(yōu)于有糖培養(yǎng)苗。

4.1.3 生產(chǎn)周期短

在本試驗(yàn)中，無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖處理的蘋(píng)果種苗生產(chǎn)時(shí)間比有糖培養(yǎng)微繁殖處理減少了23 d，且最終的種苗移栽成活率提高24.39%。究其原因：植物有糖培養(yǎng)容器內(nèi)蘋(píng)果試管苗的生長(zhǎng)環(huán)境與外界環(huán)境的差異較大，且高溫高濕的環(huán)境易造成蘋(píng)果試管苗的組織結(jié)構(gòu)和氣孔功能異常，在蘋(píng)果生根苗向瓶外過(guò)渡時(shí)，蘋(píng)果生根苗需要進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變（即異養(yǎng)→自養(yǎng)），并需要逐漸恢復(fù)正常的組織結(jié)構(gòu)和氣孔功能來(lái)適應(yīng)外界環(huán)境條件，這個(gè)過(guò)程需要繁瑣的煉苗程序和較長(zhǎng)的時(shí)間。而無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖處理可通過(guò)環(huán)境條件調(diào)控，使培養(yǎng)容器內(nèi)蘋(píng)果試管苗的生長(zhǎng)環(huán)境與外界環(huán)境高度相似，故蘋(píng)果生根苗對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力較好，再加上蘋(píng)果生根苗植株能夠保持正常的組織結(jié)構(gòu)和氣孔功能，能以完全光合自養(yǎng)的方式來(lái)獲取其生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分，且具有較高的光合能力，故蘋(píng)果生根苗在煉苗和移苗時(shí)，無(wú)需進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變，這不僅大大縮短了煉苗時(shí)間，還保證了良好的移栽成活率。因此，在蘋(píng)果工廠化育苗中應(yīng)用無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)，能夠有效縮短蘋(píng)果種苗的生產(chǎn)周期，簡(jiǎn)化移苗過(guò)渡程序。

4.2 關(guān)于植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用

植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)在蘋(píng)果工廠化育苗中的成功應(yīng)用，為其他作物工廠化育苗提供了良好的參考借鑒，相信在未來(lái)的種苗工廠化生產(chǎn)中，植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)將有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

值得注意的是，植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)在應(yīng)用時(shí)，對(duì)其培養(yǎng)容器內(nèi)部的環(huán)境條件調(diào)控顯得極為關(guān)鍵，這也對(duì)培養(yǎng)容器提出了較高的要求。目前，關(guān)于植物無(wú)糖培養(yǎng)裝置的開(kāi)發(fā)，國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行了不少試驗(yàn)和研究[9]，但以往研發(fā)出的無(wú)糖培養(yǎng)裝置多為大體積的箱式培養(yǎng)系統(tǒng)，該類(lèi)系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)室的改造要求較大，且價(jià)格昂貴，再加上植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)在前期的接種操作和后期的培養(yǎng)管理上，均較為不便，這就導(dǎo)致植物無(wú)糖培養(yǎng)微繁殖技術(shù)難以在種苗規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上進(jìn)行應(yīng)用，相關(guān)裝置設(shè)備也難以在組培苗生產(chǎn)中進(jìn)行大面積應(yīng)用，這些問(wèn)題均有待進(jìn)一步研究解決。