黃小鳳，韋陽連，袁 葉，余金昌，袁志永，王偉山

(東莞植物園，廣東 東莞 523086)

荔枝(LitchichinensisSonn.)起源于中國，屬于特色農(nóng)產(chǎn)品之一。目前，國內(nèi)荔枝栽培面積約5.3×105hm2，形成了海南特早熟、粵桂西南早熟、粵桂中部中熟、粵東閩南晚熟、瀘州特晚熟等特色優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)[1，2]。荔枝品種眾多，表型多樣性豐富。1982年，傅玲娟等[3]在海南島調(diào)查發(fā)現(xiàn)，野生荔枝的葉片、果實表型多樣，根據(jù)果皮特征可分為3種類型；1986年，吳仁山以果皮特征為一級分類標準，果形為二級分類標準，其他性狀為三級和四級分類標準，將廣西的荔枝品種分為7大類[4]；吳淑嫻[5]在前人研究基礎上，以成熟果實中部果皮上龜裂片和裂片峰的主要特征作為分類標準，將全國200余份荔枝品種分為果皮龜裂片尖突型、隆起型、平坦型3大類型，每個類型均包含多種形態(tài)的裂片峰。荔枝豐富的表型多樣性是其遺傳多樣性在形態(tài)上的體現(xiàn)。

荔枝遺傳多樣性研究對其資源保護和開發(fā)利用具有重要意義。隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA分子標記技術已成為遺傳多樣性研究的有效方法。目前，研究者已利用RAPD、AFLP、ISSR、EST-SSR、SNP、SRAP等分子標記[6-12]對荔枝品種資源進行了親緣關系及遺傳多樣性研究，說明將分子標記方法用于荔枝種質(zhì)資源研究具有較高的可行性和有效性。

栽培植物的核心種質(zhì)庫能以最小的品種數(shù)量和遺傳重復，最大程度地代表整個物種資源的遺傳多樣性，核心種質(zhì)庫的構建能夠提高種質(zhì)資源的管理和利用效率，已成為國內(nèi)外植物種質(zhì)資源研究的重點[13]。目前，已經(jīng)利用分子標記構建了水稻(OryzasativaLinn.)、核桃(JuglansregiaLinn.)、杏(ArmeniacavulgarisLinn.)、木荷(SchimasuperbaGardn.et Champ.)、杉木〔Cunninghamialanceolata(Lamb.)Hook.〕和建蘭〔Cymbidiumensifolium(Linn.)Sw.〕等植物的核心種質(zhì)庫[14-19]。荔枝樹體高、占地面積大，其活植物保存需要占用大量土地。為了能夠在有限的土地上盡可能多地保存荔枝品種資源，維持其遺傳多樣性，宜利用分子標記構建荔枝核心種質(zhì)庫。

作者所在課題組現(xiàn)收集到荔枝品種(品系)221份，且大多數(shù)品種(品系)的遺傳多樣性和親緣關系未知。為客觀評價荔枝品種資源的遺傳多樣性，弄清品種間的遺傳關系，作者利用SNP分子標記對收集的荔枝品種(品系)進行遺傳多樣性和遺傳關系分析，并在此基礎上構建荔枝核心種質(zhì)庫，以期高效保存荔枝種質(zhì)資源的遺傳多樣性，有效提高其管理水平，為荔枝種質(zhì)資源的管理與利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試樣本為從廣東、廣西、福建、海南和四川收集的221份荔枝品種(品系)，包括154份晚熟品種(品系)(編號1～154)、50份中熟品種(品系)(編號155～204)、11份早熟品種(品系)(編號205～215)、6份特早熟品種(品系)(編號216～221)，各品種(品系)的名稱和來源地見附錄Ⅰ。

供試品種(品系)均種植于東莞植物園荔枝種質(zhì)資源圃內(nèi)。該種質(zhì)圃地處南亞熱帶季風氣候區(qū)，光照充足、熱量豐富、雨量充沛，圃內(nèi)土壤為赤壤土。

每份樣本選擇3株單株，株齡為4～14 a，在每株樣株中上部的健康老熟枝條上各采集1枚老熟葉片，于-70 ℃保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測 采用CTAB小樣法[20]提取葉片DNA并進行純度檢測，于-20 ℃保存、備用。

1.2.2 SNP分型 從Liu等[11]開發(fā)的155對SNP引物中篩選出分型穩(wěn)定、多態(tài)性高的19對SNP引物進行PCR擴增反應，供試引物基本信息見表1。PCR擴增體系總體積10.0 μL，包括10 ng·μL-1基因組DNA 2.0 μL、5 U·μL-1rTaqDNA聚合酶〔寶生物工程(大連)有限公司〕0.6 μL、10×Buffer(含Mg2+)1.0 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.2 μL、10 mmol·L-1正向和反向引物各0.3 μL，滅菌超純水補足剩余體積。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性45 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共50個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。SNP基因分型及數(shù)據(jù)分析參考孫清明等[21]。

表1 供試19對SNP引物的基本信息

1.2.3 遺傳多樣性和遺傳結構分析 利用GenAlEx 6.5軟件計算觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、遺傳分化系數(shù)和遺傳距離，并進行分子方差變異分析(AMOVA)。參照文獻[22]劃分群體遺傳分化程度。

采用PowerMarker V3.25軟件計算多態(tài)性信息含量；采用STRUCTURE 2.3.4軟件對供試樣本進行分組和群體遺傳結構分析，根據(jù)ΔK值最大原則確定最佳分組數(shù)；最后，利用MEGA 5.2軟件，基于遺傳距離采用UPGMA法構建系統(tǒng)樹。

1.2.4 核心種質(zhì)庫的構建與評價 按照供試荔枝品種(品系)的果實成熟期進行分組，參照文獻[18]的方法篩選并構建核心種質(zhì)庫。運用PowerMarker V3.25 軟件設置取樣比例為10%、15%、20%、25%和30%，根據(jù)模擬退火算法(simulated annealing algorithm)以等位基因最大化(maximizing allelic richness)為標準構建核心種質(zhì)庫；利用GenAlEx 6.5軟件計算核心品種(品系)、原有品種(品系)和保留品種(品系)的遺傳多樣性參數(shù)，并通過計算遺傳多樣性參數(shù)的保留率〔核心品種(品系)某一指標占原有品種(品系)同一指標的百分率〕以及t檢驗評價核心品種(品系)、保留品種(品系)和原有品種(品系)的遺傳多樣性，同時運用主坐標分析法(PCoA)對構建的核心種質(zhì)庫進行確認。

2 結果和分析

2.1 SNP引物和荔枝品種(品系)群體的遺傳多樣性分析

2.1.1 SNP引物的遺傳多樣性參數(shù)分析 利用19對SNP引物對供試的221份荔枝樣本進行擴增，各引物的遺傳多樣性參數(shù)見表2。

由表2可見：每對SNP引物的觀測等位基因數(shù)均為2，有效等位基因數(shù)為1.1～2.0，均值為1.5；Shannon’s信息指數(shù)為0.236～0.692，均值為0.482；觀測雜合度為0.081～0.561，均值為0.282；期望雜合度為0.119～0.499，均值為0.314；多態(tài)性信息含量為0.112～0.374，均值為0.256。其中，引物SNP7的有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、期望雜合度和多態(tài)性信息含量均最高。

表2 用于221份荔枝樣本SNP分子標記分析的19對引物的遺傳多樣性參數(shù)

2.1.2 荔枝品種(品系)群體的遺傳多樣性分析 基于SNP分子標記分析結果，對不同果實成熟期荔枝品種(品系)群體的遺傳多樣性參數(shù)進行分析，結果見表3。

由表3可見：供試荔枝品種(品系)群體的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度的均值分別為1.9、1.6、0.487、0.372和0.327。在4個荔枝品種(品系)群體中，荔枝晚熟品種(品系)群體的有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀察雜合度和期望雜合度均最小，早熟品種(品系)群體的上述遺傳多樣性指標均最大，表明荔枝早熟品種(品系)群體的遺傳多樣性最高，荔枝晚熟品種(品系)群體的遺傳多樣性最低。

表3 基于SNP分子標記的不同果實成熟期荔枝品種(品系)群體的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 荔枝品種(品系)群體的遺傳分化和遺傳結構

基于SNP分子標記分析結果，對不同果實成熟期荔枝品種(品系)群體的遺傳分化和遺傳結構進行分析，結果分別見表4、表5和圖1。

2.2.1 荔枝品種(品系)群體的遺傳分化 分子方差分析(AMOVA)結果(表4)顯示：供試荔枝品種(品系)樣本個體間的遺傳變異貢獻率為85%，群體間和群體內(nèi)的遺傳變異貢獻率分別為10%和5%，表明供試荔枝品種(品系)群體的遺傳變異主要發(fā)生在個體間，群體間遺傳變異不明顯。

表4 荔枝品種(品系)群體的AMOVA分析結果

由表5可見：中熟品種(品系)群體與早熟和晚熟品種(品系)群體間的遺傳分化程度很低，遺傳分化系數(shù)分別為0.046和0.021；早熟品種(品系)群體與特早熟和晚熟品種(品系)群體間的遺傳分化程度較低，遺傳分化系數(shù)分別為0.081和0.096；特早熟品種(品系)群體與中熟和晚熟品種(品系)群體間的遺傳分化程度中等，遺傳分化系數(shù)分別為0.166和0.246。晚熟品種(品系)群體與中熟、早熟和特早熟品種(品系)群體間的遺傳距離依次增大，遺傳距離分別為0.014、0.091和0.352；特早熟品種(品系)群體與早熟、中熟和晚熟品種(品系)群體間的遺傳距離也依次增大，遺傳距離分別為0.109、0.240和0.352。表明供試荔枝品種(品系)群體的果實成熟時間相差越大，其遺傳距離越大。

表5 基于SNP分子標記的不同果實成熟期荔枝品種(品系)群體間的遺傳距離和遺傳分化系數(shù)1)

總體上看，供試荔枝品種(品系)群體間的遺傳分化系數(shù)和遺傳距離均與果實成熟期相關，果實成熟期相距越遠，遺傳分化系數(shù)和遺傳距離越大。

2.2.2 荔枝品種(品系)群體的遺傳結構 基于SNP分子標記的不同果實成熟期荔枝品種(品系)群體的分組結果(圖1-A)表明：在K=2時，ΔK達到最大值，說明供試荔枝品種(品系)群體在分成2組時遺傳結構最明顯。

遺傳結構分析結果(圖1-B)表明：供試的221份荔枝品種(品系)適合劃分為2組。其中，a組Q值為0.501～0.995，包含181份荔枝品種(品系)，主要為中熟和晚熟品種(品系)，分別為32和145份品種(品系)，另包含4份早熟品種(品系)；b組的Q值為0.550～0.997，包含40份荔枝品種(品系)，包括所有特早熟品種(品系)(6份)、大部分早熟品種(品系)(7份)、少部分中熟品種(品系)(18份)及極少部分晚熟品種(品系)(9份)。

K: 分組數(shù)Cluster number.: a組Group a; : b組Group b.P1: 晚熟品種(品系)Late-maturing cultivar(strain); P2: 中熟品種(品系)Mid-maturing cultivar(strain); P3: 早熟品種(品系)Early-maturing cultivar(strain); P4: 特早熟品種(品系)Extremely early-maturing cultivar(strain).

2.3 荔枝品種(品系)群體的聚類分析

根據(jù)SNP分子標記分析結果、基于遺傳距離對221份荔枝品種(品系)進行UPGMA聚類分析，結果見圖2。

由圖2可見：在遺傳距離0.18處，可將供試荔枝品種(品系)分為3組。特早熟品種(品系)‘荷包荔’(‘Hebaoli’)(編號216)和‘三月紅’(‘Sanyuehong’)(編號219)與絕大多數(shù)品種(品系)的遺傳距離較遠，二者聚為Ⅰ組；另219份品種(品系)可劃分為2組(Ⅱ組和Ⅲ組)。其中，Ⅱ組包含39份品種(品系)，包括4份特早熟品種(品系)、10份晚熟品種(品系)、18份中熟品種(品系)和7份早熟品種(品系)；Ⅲ組包含180份品種(品系)，包括144份晚熟品種(品系)、32份中熟品種(品系)和4份早熟品種(品系)。

將圖2中Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組包含的品種(品系)分別與圖1中基于遺傳結構的分組結果進行比對，結果顯示：Ⅰ組和Ⅱ組包含的41份品種(品系)中，有36份品種(品系)出現(xiàn)在圖1的b組中；Ⅲ組包含的180份品種(品系)中，有177份品種(品系)出現(xiàn)在圖1的a組中。表明聚類分析和遺傳結構分析結果基本一致。

: 晚熟品種(品系)Late-maturing cultivars(strains); : 中熟品種(品系)Mid-maturing cultivars(strains); : 早熟品種(品系)Early-maturing cultivars(strains); : 特早熟品種(品系)Extremely early-maturing cultivars(strains).1-221：品種(品系)編號Nos.of cultivars(strains).

2.4 荔枝核心種質(zhì)庫的構建和評價

2.4.1 荔枝核心種質(zhì)庫構建 用PowerMarker V3.25軟件設置不同的取樣比例并構建核心種質(zhì)庫，其遺傳多樣性參數(shù)見表6。

表6 按照不同取樣比例構建的荔枝核心種質(zhì)庫的遺傳多樣性參數(shù)1)

結果表明：取樣比例為20%構建的核心品種(品系)群體能最大程度地保留原有品種(品系)群體的遺傳多樣性，其觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度的保留率分別為100%、100%、106%、103%和107%，表明該取樣比例篩選出來的荔枝核心品種(品系)群體能充分體現(xiàn)原有品種(品系)群體的遺傳多樣性，可確作為荔枝核心種質(zhì)庫。

核心種質(zhì)庫包含44份品種(品系)(詳見附錄Ⅰ)，其中晚熟品種(品系)有31份，占晚熟品種(品系)總數(shù)的20.1%；主要為來源于海南的品種(品系)(18份)，來源于福建和四川的品種(品系)分別有5和2份，來源于廣東和廣西的品種(品系)均有3份。中熟品種(品系)有8份，占中熟品種(品系)總數(shù)的16.0%；來源于廣東、廣西、福建和四川的品種(品系)各有2、3、1和2份。早熟品種(品系)有2份，分別來源于廣東和福建，占早熟品種(品系)總數(shù)的18.2%；特早熟品種(品系)有3份，分別來源于廣東、福建和四川，占特早熟品種(品系)總數(shù)的50.0%?？傮w上看，核心種質(zhì)庫包含的品種(品系)全面涵蓋原有品種(品系)群體的果實成熟期和來源地，說明該核心種質(zhì)庫較全面地保留了供試荔枝品種(品系)的相關信息。

2.4.2 荔枝核心種質(zhì)庫評價 將荔枝核心種質(zhì)庫中包含的核心品種(品系)群體與原有品種(品系)群體和保留品種(品系)群體的遺傳多樣性參數(shù)進行對比，結果見表7；對荔枝核心品種(品系)群體與原有品種(品系)群體進行主坐標分析(PCoA)，結果見圖3。

表7 荔枝核心品種(品系)群體與其他品種(品系)群體的遺傳多樣性參數(shù)對比

: 核心品種(品系)Core cultivar(strain); : 原有品種(品系)Initial cultivar(strain).

由表7可見：核心品種(品系)群體的Shannon’s信息指數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度均高于原有品種(品系)群體和保留品種(品系)群體，表明核心品種(品系)群體的遺傳多樣性相對較高。t檢驗結果顯示：3個供試群體的遺傳多樣性參數(shù)均無顯著差異，表明核心品種(品系)群體可以代表原有品種(品系)群體，且保留品種(品系)群體可作為核心種質(zhì)庫的備用資源。

由圖3可見：核心品種(品系)均勻分布在整個供試群體中，且核心品種(品系)還包含特早熟品種(品系)‘荷包荔’和‘三月紅’，表明該荔枝核心種質(zhì)庫的代表性較強。

3 討論和結論

3.1 荔枝品種(品系)的遺傳多樣性及變異來源

遺傳多樣性研究對植物種質(zhì)資源的利用、保護和進化具有重要意義。本研究利用19對SNP引物對221份荔枝品種(品系)進行了遺傳多樣性研究，Shannon’s信息指數(shù)為0.236～0.692，觀測雜合度為0.081～0.561，表明供試的荔枝品種(品系)樣本具有較高的遺傳多樣性。荔枝群體遺傳多樣性豐富可能與其品種(品系)間的自然雜交有關。荔枝起源于云南，后沿著西江傳播至海南，并在云南和海南分別馴化為特早熟和晚熟品種(品系)，這2類品種(品系)進一步雜交形成早熟和中熟品種(品系)[23]；荔枝為異花授粉植物，遺傳基礎十分復雜，基因型為雜合型，荔枝品種(品系)間的自然雜交使其品種(品系)間的遺傳物質(zhì)交流頻繁，引起遺傳變異和遺傳多樣性的增加[24]。

在基于SNP分子標記數(shù)據(jù)構建的UPGMA聚類圖中，供試的221份荔枝樣本可分為3組，Ⅰ組的2份樣本均屬于特早熟品種(品系)，Ⅲ組的絕大多數(shù)樣本屬于晚熟品種(品系)；Ⅱ組中，靠近Ⅰ組的樣本多屬于特早熟或早熟品種(品系)，靠近Ⅲ組的樣本多屬于中熟品種(品系)。在聚類圖上，供試品種(品系)的分布整體呈現(xiàn)兩端分別為特早熟和晚熟品種(品系)、中間為早熟和中熟品種(品系)的特點，基本符合“荔枝先獨立馴化為特早熟和晚熟品種，這2類品種再進一步雜交形成早熟與中熟品種”[23]的研究結論。但在聚類圖中也出現(xiàn)少數(shù)不同果實成熟期的品種(品系)聚在同組的現(xiàn)象，這可能與不同區(qū)域之間的相互引種以及品種(品系)間的自然雜交有關。引種和自然雜交過程均可促進品種(品系)間的基因交流，進而產(chǎn)生具有多種遺傳特性的后代，但若品種(品系)之間具有親緣關系，則無論其果實成熟期是否一致，都有可能聚在一起。

3.2 荔枝品種(品系)的分類標準

目前，多根據(jù)果皮特征將荔枝品種(品系)分為尖突型、隆起型和平坦型3大類型，但這一分類體系并不能準確反映品種(品系)間的親緣關系。隨著分子生物技術的廣泛應用，有研究者發(fā)現(xiàn)依據(jù)分子標記獲得的荔枝樣本的分組結果同時表現(xiàn)出依果實成熟期分組的特點，因而提出將果實成熟期作為荔枝品種資源分類的首要標準[25]。Liu等[26]基于RAPD分子標記技術，將60份荔枝樣本按果實成熟期分為極早熟、早中熟和晚熟至極晚熟3組；基于SSR分子標記技術，傅嘉欣[27]發(fā)現(xiàn)供試47份荔枝樣本可分為3大組，分組結果與果實成熟期具有較好的一致性[25]；Liu等[11]基于SNP技術，將96份荔枝樣本按照果實成熟期聚為特早熟、早熟、中熟和晚熟4組。本研究中，供試221份荔枝品種(品系)的果實成熟期相差明顯，且果實成熟期相差越大的荔枝群體，其遺傳分化系數(shù)和遺傳距離也越大，但在UPGMA聚類圖中供試221份荔枝樣本并未完全按照果實成熟期聚類，其中，Ⅲ組主要為晚熟和中熟品種(品系)并包含少量早熟品種(品系)，而Ⅱ組中4個果實成熟期的品種(品系)均有。造成這一現(xiàn)象的原因可能與供試樣本的數(shù)量有關，供試樣本越多，攜帶的遺傳信息越多，產(chǎn)生遺傳變異的可能性越大，不確定的影響因子也更多。本研究中供試荔枝樣本的期望雜合度(0.314)高于Liu等[11]的研究結果(0.305)，可見研究對象的有效樣本量越大，產(chǎn)生遺傳變異的可能性越大，其期望雜合度越高。

2021年，國家荔枝種質(zhì)資源圃在茂名建成，收集了國內(nèi)外700多份荔枝種源，今后應以盡可能多的種質(zhì)資源為供試材料，開展多個分子標記和多個表型性狀的相關性研究，從整體上對荔枝種質(zhì)的遺傳背景和表型進行綜合分析，以探討將成熟期或其他性狀作為荔枝種質(zhì)分類新標準的科學性。

3.3 荔枝核心種質(zhì)庫的構建及其意義

保存大量的種質(zhì)資源可為荔枝遺傳改良和品種選育提供豐富的遺傳基礎，但荔枝為多年生喬木，樹體高、占地面積大，這給荔枝種質(zhì)資源的保存帶來了一定的困難。構建荔枝核心種質(zhì)庫，可在有限的土地上保存更多的種質(zhì)資源，實現(xiàn)遺傳多樣性保藏目標。

確定合理的取樣比例是核心種質(zhì)庫構建面臨的首要問題。目前，國內(nèi)外不同植物核心種質(zhì)庫的取樣比例為5%～30%，沒有統(tǒng)一的標準。李自超等[28]認為，構建核心種質(zhì)庫時的取樣比例要根據(jù)原有樣本的數(shù)量而定，原有樣本數(shù)量大時核心種質(zhì)庫的取樣比例可相對較小，反之，取樣比例應相應增大。李冬波等[29]對廣西原產(chǎn)和引種的88份荔枝品種資源進行分析，構建了包含22份品種(品系)的核心種質(zhì)庫，占原有品種(品系)數(shù)的25%；Sun等[30]分析了不同果實成熟期的96份荔枝樣本，并篩選出22份核心樣本，占原有樣本數(shù)的23%；而本研究在供試的221份荔枝品種(品系)中篩選出44份樣本構建了核心種質(zhì)庫，占原有品種(品系)數(shù)的20%。由此可見，隨原有種質(zhì)庫中荔枝品種(品系)數(shù)的逐漸增多，核心種質(zhì)庫的取樣比例逐漸減小，這在一定程度上佐證了李自超等[28]的研究結論。

經(jīng)PCoA主坐標分析和t檢驗，采用本研究方法構建的荔枝核心種質(zhì)庫包含的品種(品系)的遺傳多樣性參數(shù)與原有種質(zhì)庫無顯著差異，且該核心種質(zhì)庫涵蓋了原有種質(zhì)庫的所有品種(品系)的果實成熟期和來源地，說明構建的核心種質(zhì)庫具有很好的代表性，在實際育種工作中可優(yōu)先考慮使用核心種質(zhì)庫的品種(品系)作為育種材料。當土地資源減少，無法保存所有供試品種(品系)的活植物時，應優(yōu)先保存核心種質(zhì)庫的品種(品系)，以維持其遺傳多樣性。

目前，早熟品種不優(yōu)質(zhì)是荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨的主要問題之一，選育早熟優(yōu)質(zhì)荔枝品種(品系)是荔枝重要的育種目標。本研究結果顯示：特早熟品種(品系)‘荷包荔’和‘三月紅’與絕大多數(shù)品種(品系)的遺傳距離較遠，且為核心品種(品系)，在早熟品種(品系)育種工作中可考慮選擇‘荷包荔’和‘三月紅’與優(yōu)質(zhì)荔枝品種(品系)進行雜交，以選育早熟優(yōu)質(zhì)荔枝品種(品系)。