樊志浩，李玉林，張恒，王旭東，王云龍,4

1.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001；2.河南省生物工程技術研究中心，河南 鄭州 450121；3.河南省職工醫(yī)院，河南 鄭州 450002；4.鄭州職業(yè)技術學院 生物工程系，河南 鄭州 450121

0 引言

冠狀病毒是一大類病毒的總稱，屬巢病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)正冠狀病毒亞科(Orthocoronavirinae)，分為α、β、γ和δ4個屬[1]。α和β冠狀病毒屬主要為哺乳動物冠狀病毒，γ冠狀病毒屬主要為禽類冠狀病毒，而δ冠狀病毒屬既包括哺乳動物冠狀病毒，也包括鳥類冠狀病毒。冠狀病毒已在禽類宿主(雞、火雞、鴨和鵝)和哺乳動物(駱駝、蝙蝠、果子貍、老鼠、狗和貓)中被鑒定出來[2]。人們喜食野味的習慣使冠狀病毒由動物傳播感染人類成為可能，目前已知的有α屬229E、NL63，β屬OC43、HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2[3-4]。新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠狀病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起人發(fā)熱、乏力、干咳和呼吸困難的傳染病，部分患者甚至會出現急性呼吸窘迫綜合征，并伴有呼吸衰竭及嚴重的低氧血癥。新型冠狀病毒變異性極強，已產生了多種變異株，目前新型冠狀病毒的變異株奧密克戎系毒株傳播速度比以往任何變種都快[5-7]。除核酸檢測外，建立準確、快速的抗體檢測方法對新型冠狀病毒的防控具有重要意義[8]。

SARS-CoV-2有包膜，有約30 kb的單股正鏈RNA基因組，含4種主要結構蛋白。其中，核衣殼蛋白(Nucleocapsid Protein，N蛋白)作為新型冠狀病毒中的一種重要結構蛋白，其結構域由3個互不相同但高度保守的部分組成：N末端RNA結合結構域(NTD)、C末端二聚結構域(CTD)和本質上無序的富含Ser/Arg(SR)的中心連接子。NTD負責RNA結合，CTD負責齊聚，中心連接子負責初級磷酸化[9-11]。N蛋白具有很強的免疫原性，可誘導機體產生特異的免疫反應，是針對野生動物和人診斷檢測的主要靶標[12-13]。研究[14]發(fā)現，新型冠狀病毒編碼的N蛋白對宿主核因子κB(NF-κB)通路及炎癥反應具有促進作用，揭示了N蛋白通過“液-液”相分離(LLPS)招募NF-κB轉化生長因子激酶1(TAK1)及關鍵激酶IKKβ，并形成相分離復合體的分子機制，為新型冠狀肺炎的治療提出了靶向相分離的新型抑炎策略。

基于此，本研究擬采用生物信息學方法對SARS-CoV-2 N蛋白進行親疏水性、抗原表位預測及多序列比對分析，構建含SARS-CoV-2 N蛋白基因的重組質粒，在大腸桿菌原核表達體系下，通過調整誘導溫度和時間，實現蛋白的可溶性表達并使其表達量最高，建立蛋白純化體系，以期得到濃度和純度均較高的具有特異性的重組N蛋白，為快速診斷方法的建立、優(yōu)化和單抗藥物的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NdeⅠ、XhoⅠ核酸內切酶，寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司產；質粒小提試劑盒、通用型純化回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產；Ni-NTA親和層析填料，通用電氣(GE)公司產；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)干粉、二硫蘇糖醇(DTT)、二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色液、牛血清白蛋白(BSA)，上海索萊寶生物科技有限公司產；PageRuler蛋白Marker，賽默飛世爾科技公司產；PR1920蛋白Marker，北京索萊寶科技有限公司產；卡那霉素(Kana)、咪唑、含SARS-CoV-2 N蛋白基因全長序列的重組質粒，生工生物工程(上海)有限公司產；聚偏氟乙烯(PVDF)膜，杭州沃森生物技術有限公司產；脫脂奶粉，內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司產；磷酸緩沖液(PB)、磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)、His-tag抗體，由河南省生物工程技術研究中心提供。

1.2 主要儀器與設備

XK26/20型層析柱、XK50型凝膠過濾層析柱，通用電氣(GE)公司產；GL-21M型高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產；LDZF-50KB-Ⅱ型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產；Y1515X型蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司產；HD-9705型紫外檢測儀，上海精科實業(yè)有限公司產；SPH-100B型恒溫搖床，上海世平實驗設備有限公司產；ChemiDolTMXRS+凝膠成像儀，伯樂(Bio-Rad)公司產。

1.3 實驗方法

1.3.1SARS-CoV-2N蛋白結構分析與抗原表位預測利用ExPASy中的ProtScale模塊(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析SARS-CoV-2 N蛋白的疏水性，利用TMpred(https:∥embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)分析蛋白序列的跨膜區(qū)間，利用DNAstar7.1軟件中的Protean模塊預測該蛋白的親水性、抗原指數等參數[15]。通過EMBL-EBI數據庫對 SARS-CoV-2(YP_009724397.2)、SARS冠狀病毒(SARS-CoV，NP_828858.1)、蝙蝠冠狀病毒(Bat coronavirus，AGC74169.1)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV，YP_009047211.1)的N蛋白進行氨基酸多序列比對。

1.3.2 基因及引物序列合成根據NCBI上的SARS-CoV-2/human/USA/UF-2/2020(GenBank:MT295465.1)序列，選擇N蛋白基因全長序列，在N端和C端分別加入His-tag，通過密碼子優(yōu)化，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成基因，目的基因序列連入載體pUC57。通過引物設計軟件Primer premier 5設計引物序列，上游和下游引物分別加上NdeⅠ和XhoⅠ核酸內切酶的酶切位點，其序列如下：N-F(5′-GGAATTCCATATGAGCGATAATGGTCCG-3′)；N-R(5′-CCGCTCGAGGGC-CTGGGTACTATC-3′)。

1.3.3 重組質粒構建與鑒定以pUC57/N為模板，N-F和N-R為引物，擴增SARS-CoV-2 N蛋白基因靶序列。用NdeⅠ和XhoⅠ核酸內切酶分別雙酶切載體pET28a和PCR擴增的N蛋白基因靶序列，回收、連接并轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。單克隆陽性鑒定后，通過雙酶切和測序進行重組質粒的鑒定，結果正確的重組質粒命名為pET-28a/N。

1.3.4SARS-CoV-2N蛋白的表達條件篩選將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落加入Kana抗性的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、210 r/min搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)4～5 h，至OD為1.0時，加入誘導劑IPTG使其終濃度為0.2 mmol/L，分別在37 ℃(5 h)、25 ℃(10 h)、16 ℃(20 h)這3種不同的溫度和時間下誘導大腸桿菌表達N 蛋白。發(fā)酵結束后，離心收集菌體沉淀，加入適量的緩沖液A(20 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，pH 值8.0)重懸浮，冰浴超聲破碎完全后，在4 ℃條件下高速離心，收集上清液和沉淀，進行還原性十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳鑒定。

1.3.5 目的蛋白親和層析純化將Ni-NTA親和層析填料平衡至室溫后，倒入層析柱中，靜置。層析柱兩端分別連接于蠕動泵和紫外檢測儀，流速為2.5 mL/min，用緩沖液A平衡5個柱體，備用。

在上述最佳誘導條件下誘導N蛋白表達。收集的菌體用適量緩沖液A重懸浮，冰浴超聲破碎完全后，高速冷凍離心并收集上清液。上清液經0.45 μm濾膜過濾后上樣，流速為1 mL/min，用緩沖液A繼續(xù)沖洗至基線左右。用緩沖液B(20 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，100 mmol/L 咪唑，pH 值8.0)洗滌除雜，至基線左右后，用緩沖液C(20 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L 咪唑，pH 值8.0)洗脫目的蛋白。收集目的蛋白，進行還原性SDS-PAGE電泳檢測。

1.3.6 目的蛋白凝膠過濾層析純化用截留相對分子質量為30 000的濃縮管對親和層析純化后的目的蛋白進行濃縮，并使用低鹽緩沖液D(20 mmol/L PB，150 mmol/L NaCl，1 mmol/LDTT，pH 值8.0)進行緩沖液置換，于4 ℃、6000 r/min條件下離心10 min，離心結束后用移液器輕輕吹打濃縮管壁，將蛋白液充分混勻后倒出。使用凝膠過濾層析柱對濃縮后的蛋白液進一步純化，用緩沖液D平衡層析柱，流速為2.5 mL/min，平衡完成后進行上樣，流速為1 mL/min。分別收集蛋白洗脫液，進行還原性SDS-PAGE電泳鑒定。

1.3.7 目的蛋白免疫印記檢測將上述純化后的目的蛋白和BSA(陰性對照)經還原性SDS-PAGE分離后轉印至PVDF膜。轉膜后用PBST清洗3次，每次5 min，再浸泡于封閉液(含0.05 g/mL脫脂奶粉的PBST溶液)中，于37 ℃條件下封閉2 h。在封閉液中加入按體積比1∶2000稀釋的His-tag抗體，室溫振蕩孵育2 h；用PBST洗滌3次，每次5 min；最后使用DAB顯色液閉光進行顯色，觀察顯色結果。

2 結果與分析

2.1 SARS-CoV-2 N蛋白跨膜結構、抗原表位預測和多序列比對分析

SARS-CoV-2 N蛋白抗原表位預測和多序列比對結果如圖1所示。由圖1a)可知，SARS-CoV-2 N蛋白編碼419個氨基酸，等電點(PI)為10.10，無跨膜區(qū)，無信號肽序列，局部親水性較強，全長蛋白抗原指數較高，若進行全長表達，可引起良好的免疫。由圖1b)可知，N蛋白編碼區(qū)的遺傳穩(wěn)定性較高，SARS-CoV-2 N蛋白與其他典型的冠狀病毒N蛋白比對,中間序列相似性高，N蛋白序列具有保守性；SARS-CoV-2 N蛋白與SARS-CoV同源性為90.5%，與Bat coronavirus同源性為91.0%，與MERS-CoV同源性為49.7%，且在N端和C端顯示出明顯差異。

2.2 重組質粒構建與鑒定分析

PCR擴增和重組質粒酶切鑒定結果如圖2所示，其中，M為DNA Marker，圖2a)中1為PCR擴增產物，圖2b)中1為pET28a/N的雙酶切產物。由圖2a)可知，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳顯示了單一條帶，大小與預期相符(1257 bp)。由圖2b)可知，將PCR產物回收，雙酶切后的線性化載體pET28a 連接并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行菌液PCR和雙酶切鑒定，結果顯示有兩條較明顯的條帶，其中位于1257 bp的條帶是雙酶切后的目的基因，位于5369 bp左右的條帶是雙酶切后的線性化載體pET28a。

圖2 PCR擴增和重組質粒酶切鑒定結果

2.3 SARS-CoV-2 N蛋白可溶性分析

SARS-CoV-2 N重組蛋白在3種不同溫度誘導下的表達結果如圖3所示，其中，M為蛋白Marker，1為37 ℃誘導后的上清液，2為37 ℃誘導后的沉淀，3為25 ℃誘導后的上清液，4為25 ℃誘導后的沉淀，5為16 ℃誘導后的上清液，6為16 ℃誘導后的沉淀。由圖3可知，工程菌BL21(DE3)/pET28a/N在IPTG終濃度為0.2 mmol/L時，在25 ℃和16 ℃誘導下的上清液中均出現了一條明顯目的條帶，證明SARS-CoV-2 N蛋白為可溶性蛋白，且其在16 ℃誘導下的表達量最高。因此確定誘導條件為工程菌在IPTG終濃度為0.2 mmol/L、16 ℃誘導20 h，蛋白呈可溶性表達，且此時蛋白的表達量最高，占總蛋白表達量的70%。

圖3 SARS-CoV-2 N重組蛋白在3種不同溫度誘導下的表達結果

2.4 目的蛋白Ni-NTA親和層析純化分析

SARS-CoV-2 N蛋白Ni-NTA親和層析純化結果如圖4所示，其中，M為蛋白Marker，1為未誘導的菌液，2為在16 ℃條件下用0.2 mmol/L IPTG誘導后的菌液，3為純化后的目的蛋白。由圖4可知，目的蛋白在300 mmol/L咪唑時被洗脫，純化后的蛋白條帶明顯，其下有一條細微條帶，SDS-PAGE電泳檢測分子質量約為55 kDa，相對分子質量的大小與預期目的蛋白大小一致，其濃度和純度均較高。

圖4 SARS-CoV-2 N蛋白Ni-NTA親和層析純化結果

2.5 目的蛋白凝膠過濾層析純化分析

SARS-CoV-2 N蛋白凝膠過濾層析純化結果如圖5所示，其中，M為蛋白Marker，1—8為純化的蛋白。由圖5可知，該目的蛋白在凝膠過濾層析后仍存在細微條帶，經凝膠成像系統(tǒng)分析，其純度可達90%以上。凝膠過濾層析純化可將親和層析純化后蛋白液中的咪唑去除，方便后續(xù)檢測方法的建立。

圖5 SARS-CoV-2 N蛋白凝膠過濾層析純化結果

2.6 目的蛋白免疫印記檢測分析

SARS-CoV-2 N蛋白免疫印跡分析結果如圖6所示，其中，1為純化后的目的蛋白，2為陰性對照，M為蛋白Marker。由圖6可知，重組蛋白與His-Tag抗體反應后，在55 kDa左右出現的特異性目標條帶清晰，與預期蛋白分子質量大小相符，其下細微條帶也發(fā)生了特異性反應，分析為蛋白本身產生的條帶，而在陰性對照組中未見目標條帶，證實特異性目標條帶為目的蛋白。

圖6 SARS-CoV-2 N蛋白免疫印跡分析結果

3 結論

本文采用生物信息學手段對SARS-CoV-2 N蛋白進行親疏水性、跨膜區(qū)、抗原表位預測及多序列比對分析發(fā)現，SARS-CoV-2 N蛋白等電點(PI)為10.10，無跨膜區(qū)，無信號肽序列，局部親水性較強，全長蛋白抗原指數較高，全長表達可引起良好的免疫，序列具有保守性，與SARS-CoV同源性為90.5%，與Bat coronavirus同源性為91.0%，與MERS-CoV同源性為49.7%，且中間序列相似性較高，在N端和C端顯示出明顯差異，可成為診斷分析藥物的合適候選靶點；本文選取SARS-CoV-2蛋白基因組中保守性強的N蛋白基因作為目的基因插入到pET28a載體中，成功構建了重組質粒，大腸桿菌原核表達蛋白在16 ℃低溫誘導條件下以可溶性蛋白的形式存在，且其表達量占總蛋白表達量的70%；純化得到的重組N蛋白的純度達90%，通過該方法能夠得到純度和濃度均較高的目的蛋白。本研究所構建的重組N蛋白可作為診斷抗原，也可用于制備抗血清抗體或單克隆抗體，而建立酶聯(lián)免疫吸附劑測定、免疫熒光技術、膠體金免疫層析等快速檢測方法，有望協(xié)助新型冠狀病毒的診斷和防控。