孫萍，王夢曼，王淑玲，孫京新,2,3 ，苗春偉，黃河，戴愛國，張晶

1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島特種食品研究院，山東 青島 266109；3.山東省肉類食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，山東 青島 266109；4.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東 青島 266000；5.青島波尼亞食品有限公司，山東 青島 266100

0 引言

發(fā)酵肉制品是指鮮肉受微生物及自身酶的影響發(fā)生物理、化學(xué)及生物變化，從而獲得獨(dú)特風(fēng)味、色澤和質(zhì)地的肉制品，具有可即食、高營養(yǎng)、性狀穩(wěn)定、保質(zhì)期長等優(yōu)點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛[1]。細(xì)菌、酵母和霉菌都可以用作發(fā)酵肉制品的發(fā)酵劑[2]。阮一凡等[3]利用植物乳桿菌和釀酒酵母菌發(fā)酵鴨腿，在賦予產(chǎn)品良好風(fēng)味的同時(shí)延長了產(chǎn)品貨架期。J.A.Arcila等[4]研究發(fā)現(xiàn)，利用木糖葡萄球菌發(fā)酵肉制品所產(chǎn)生的硝酸鹽還原酶、蛋白酶和脂肪分解酶可以保持肉制品的顏色。肉制品發(fā)酵菌株所產(chǎn)生的蛋白酶可將蛋白質(zhì)和脂肪分解為氨基酸、小肽等，有助于開發(fā)干腌肉制品的特殊香味和風(fēng)味[5]。此外，在肉制品表面接種霉菌會形成白色菌絲體，耗氧特性使其具有的抗氧化作用可防止肉制品表面過度干燥，改善肉制品質(zhì)地；蛋白水解作用也可避免成熟肉制品(如香腸和火腿)硬度過大，從而改善產(chǎn)品口感[6]。蔡嘉銘等[7]研究發(fā)現(xiàn)，由枝孢菌作為優(yōu)勢菌發(fā)酵的香腸，雜菌數(shù)量降低，氧化減緩。C.Alapont等[8]研究發(fā)現(xiàn)，青霉菌屬(如產(chǎn)黃青霉、納地青霉等)的水解蛋白和肌球蛋白活性最高，既可作為發(fā)酵菌株，也可與蛋白水解菌株聯(lián)合使用。然而，有害霉菌會影響肉制品的品質(zhì)，產(chǎn)生的霉菌毒素會污染肉制品并使其腐敗變質(zhì)，且霉菌毒素通常是穩(wěn)定的分子，一旦產(chǎn)生就很難去除[9]。因此，尋找無害且優(yōu)質(zhì)的霉菌發(fā)酵菌株對制作高品質(zhì)發(fā)酵肉制品具有重要意義。

鴨肉物美價(jià)廉，國內(nèi)外消費(fèi)者對鴨肉制品的需求量逐年增加。婁地青霉和納地青霉均屬于耐酸、耐低氧和耐高濃度CO2的霉菌，將二者加入鮮肉中進(jìn)行發(fā)酵，可以提高肉制品的風(fēng)味并降低其他有害霉菌滋生的可能性[10]。課題組前期已對婁地青霉、產(chǎn)黃青霉[11]發(fā)酵雞肉和鴨肉制品進(jìn)行了研究，均取得了良好的發(fā)酵效果?；诖?，本研究擬以新鮮鴨胸肉為原料，婁地青霉和納地青霉為發(fā)酵菌株，探究兩種霉菌對發(fā)酵鴨肉制品的理化特性和微觀結(jié)構(gòu)的影響，以期進(jìn)一步尋找適用于發(fā)酵鴨肉制品的無害且優(yōu)質(zhì)的霉菌發(fā)酵菌株，為提高發(fā)酵鴨肉制品的品質(zhì)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納地青霉(3.435 7)、婁地青霉(3.509 7)，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；新鮮鴨胸肉，山東新希望六和集團(tuán)有限公司產(chǎn)；NaCl、戊二醛、四氧化鋨、乙醇、叔丁醇、Epon-812環(huán)氧樹脂，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Systems公司產(chǎn)；7500F型掃描電子顯微鏡(SEM)，日本電子株式會社(JEOL)產(chǎn)；EM UC7型超薄切片機(jī)，德國萊卡公司產(chǎn)；HT7700型透射電子顯微鏡(TEM)，日本日立高新技術(shù)公司產(chǎn)；JY Labram HR 800型顯微激光拉曼光譜儀，法國Jobin-Yvon公司產(chǎn)；MicroMR20-025型低場核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技有限公司產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 婁地青霉和納地青霉菌懸液的制備將婁地青霉和納地青霉菌株分別接入察氏瓊脂培養(yǎng)基斜面，于22 ℃條件下恒溫培養(yǎng)4 d后，用無菌水沖洗菌落并移入三角瓶(50 mL)內(nèi)，振搖后過濾，沖洗濾渣3次。將兩種霉菌的濾液分別于6000 r/min條件下離心10 min，獲得澄清的孢子懸浮液后進(jìn)行梯度稀釋，即得目標(biāo)菌懸液，備用。

1.3.2 發(fā)酵鴨肉制品的制備將新鮮鴨胸肉用手術(shù)刀切成3.0 cm×3.0 cm×1.0 cm塊狀，每個(gè)平皿(直徑10 cm)中放置4塊，并于121 ℃，0.1 MPa條件下滅菌15 min。無菌條件下，每個(gè)平皿均接種2 mL菌懸液于鴨肉中，于27 ℃條件下前發(fā)酵7 d后，將平皿中的肉塊轉(zhuǎn)移至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%的NaCl溶液中，并于30 ℃恒溫條件下密封后發(fā)酵13 d，分別制得婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品和納地青霉發(fā)酵鴨肉制品。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)測定在室溫條件下，采用質(zhì)構(gòu)儀測試發(fā)酵過程中的樣品，每個(gè)樣品均重復(fù)測試3次。參考W.Park等[12]的方法，采用TPA二次下壓法，探頭型號為P/0.5R柱狀，測試前速度為2.0 mm/s，測試中速度為1.0 mm/s，測試后速度為5.0 mm/s，下壓距離為8.0 mm，觸發(fā)力為5.0 g。測定參數(shù)為硬度、黏性和彈性。

1.3.4 微觀結(jié)構(gòu)觀察參考張丹等[13]的方法，并作適當(dāng)修改。去除發(fā)酵鴨肉制品表面的霉菌菌膜，切成0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm條狀，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液中，于4 ℃條件下固定12 h后，用磷酸緩沖鹽溶液(0.1 mol/L)漂洗6次，每次20 min；將四氧化鋨溶于磷酸緩沖鹽溶液(0.2 mol/L)中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的溶液，將漂洗后的樣品于4 ℃條件下浸入該溶液中2 h，再用磷酸緩沖鹽溶液(0.1 mol/L)漂洗6次，每次10 min；每15 min用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%和90%的乙醇溶液梯度脫水后，用純乙醇脫水3次，每次30 min；再用叔丁醇置換3次，每次30 min；真空冷凍干燥后噴金，于SEM下(電壓為15.0 kV)放大1000倍進(jìn)行觀察。再用Epon-812環(huán)氧樹脂包埋發(fā)酵鴨肉制品，采用超薄切片機(jī)切片并自然干燥，于TEM下放大1000倍觀察肌原纖維小片化程度。

1.3.5 拉曼光譜測定將樣品切薄片后，置于顯微激光拉曼光譜儀中進(jìn)行測定，波數(shù)300～3500 cm-1，120 cm-1/min掃描3次。具體參數(shù)為：激光器785 nm，功率100 mW，光柵600 g/mm，分辨率2 cm-1，孔徑200 μm，積分時(shí)間60 s。參考H.Susi等[14]的方法計(jì)算蛋白的二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲)含量。

1.3.6 低場核磁共振(LF-NMR)測定稱取去除霉菌菌膜的發(fā)酵鴨肉制品1.5 g，保鮮膜包好后裝入15 mm核磁管中，放入低場核磁共振分析儀用CPMG序列進(jìn)行橫向馳豫時(shí)間(T2)測試，使用SIRT算法進(jìn)行1 000 000次迭代擬合[15]。參數(shù)設(shè)置為：P90=4.5 μs，P180=9 μs，SW=200 kHz，D3=20 μs，TR=5000 ms，RG1=20，RG2=3，NS=4，EchoTime=300 μs，EchoCount=6000，重復(fù)掃描8次。

1.3.7 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)測定將萃取頭老化60 min后插入瓶中頂空部分，于60 ℃條件下吸附60 min后，插入GC進(jìn)樣口，于250 ℃條件下解吸2 min。

GC條件：采用毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 nm×0.25 μm)；載氣為He，流速為1.6 mL/min，不分流解析20 min；起始柱溫40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，再以10 ℃/min升溫至240 ℃，保持10 min；運(yùn)行總時(shí)間為49 min；檢測溫度為240 ℃。

MS條件：恒壓13.022 kPa，離子源溫度240 ℃，電子能量70 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析和鄧肯多重范圍檢驗(yàn)確定差異顯著性，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵鴨肉制品質(zhì)構(gòu)分析

2.1.1 硬度變化分析肉制品的硬度與蛋白變性、水解及水分流失有關(guān)，是衡量肉制品成熟度的一個(gè)指標(biāo)[16]。不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品在發(fā)酵過程中的硬度變化如圖1所示，其中，不同大寫字母表示同一發(fā)酵時(shí)間不同霉菌對發(fā)酵鴨肉制品硬度的影響差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示同一霉菌不同發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵鴨肉制品硬度的影響差異顯著(P<0.05)，下同。由圖1可知，前發(fā)酵階段，婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品的硬度可達(dá)1 561.62 g，比同時(shí)期納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的硬度(1 530.74 g)略大，且兩種霉菌發(fā)酵鴨肉制品的硬度均隨發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸增加，這可能是因?yàn)樵撾A段的霉菌菌絲體將鴨肉緊密包裹形成保護(hù)層，且霉菌的生長降低了發(fā)酵鴨肉制品的水分活度。后發(fā)酵階段，婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品和納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的硬度最終分別降至652.82 g和451.37 g，且納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的硬度比婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品顯著降低(P<0.05)，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵鴨肉制品的蛋白發(fā)生水解，致使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞。這與藍(lán)天嬋等[11]的研究結(jié)果一致。

圖1 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品在發(fā)酵過程中的硬度變化

2.1.2 黏性變化分析不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品在發(fā)酵過程中的黏性變化如圖2所示。由圖2可知，前發(fā)酵階段，兩種發(fā)酵鴨肉制品的黏性均先增大后減小，其中婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品和納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的黏性分別可達(dá)8.03 g/s和12.35 g/s。這可能是因?yàn)樵谇鞍l(fā)酵階段，霉菌數(shù)量先呈指數(shù)增長，在細(xì)胞外分泌多糖，不但會產(chǎn)生黏附于細(xì)胞表面的莢膜多糖，在細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基表面也會存在黏質(zhì)多糖[17]，導(dǎo)致發(fā)酵鴨肉制品表面的黏性增加。而當(dāng)霉菌進(jìn)入生長穩(wěn)定期后會消耗大量水分，使發(fā)酵鴨肉制品含水量下降，黏性降低。后發(fā)酵階段，婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品和納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的黏性最終分別可達(dá)36.40 g/s和47.50 g/s，且納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的黏性比婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品顯著增大(P<0.05)。這可能是因?yàn)樵诤蟀l(fā)酵階段，霉菌生長緩慢，但代謝產(chǎn)物蛋白酶可將發(fā)酵鴨肉制品中的蛋白分解為分子更小的蛋白、胨、小肽等，導(dǎo)致固形物含量降低，黏性增加[18]。納地青霉發(fā)酵鴨肉制品比婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品提前2 d到達(dá)成熟期且黏性更大，這可能是因?yàn)榧{地青霉的酶活力及對蛋白的分解能力更強(qiáng)，導(dǎo)致鴨肉蛋白分解快速徹底且結(jié)構(gòu)更松散。

圖2 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品在發(fā)酵過程中的黏性變化

2.1.3 彈性變化分析不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品在發(fā)酵過程中的彈性變化如圖3所示。由圖3可知，在發(fā)酵過程中，兩種發(fā)酵鴨肉制品的彈性總體呈下降趨勢，婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品和納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的彈性最終分別降至0.69和0.66，這可能是由于發(fā)酵對凝膠結(jié)構(gòu)造成了破壞。納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的彈性下降速率較婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品稍大，因而其最終發(fā)酵鴨肉制品的彈性更低。

圖3 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品在發(fā)酵過程中的彈性變化

2.2 發(fā)酵鴨肉制品微觀結(jié)構(gòu)分析

不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品的SEM圖和TEM圖分別如圖4和圖5所示。由圖4可知，兩種發(fā)酵鴨肉制品均無完整的肌纖維結(jié)構(gòu)，表面呈顆粒狀且相互粘連成糜狀，其中納地青霉發(fā)酵鴨肉制品比婁底青霉發(fā)酵鴨肉制品的表面平滑。S.Fadda等[19]利用植物乳桿菌提高發(fā)酵肉制品產(chǎn)酸證明了蛋白分解會影響發(fā)酵肉制品的微觀結(jié)構(gòu)。由圖5可知，兩種發(fā)酵鴨肉制品均無肌原纖維結(jié)構(gòu)，肌節(jié)斷裂為碎片狀且無規(guī)則排列，碎片間空隙明顯。這與K.Katsaras等[20]的研究結(jié)果一致。霉菌發(fā)酵對鴨肉肌原纖維結(jié)構(gòu)變化起主要作用，肌原纖維結(jié)構(gòu)的變化也印證了發(fā)酵鴨肉制品硬度顯著降低(P<0.05)、黏性顯著增大(P<0.05)是霉菌作用的結(jié)果。

圖4 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品的SEM圖(×1000)

圖5 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品的TEM圖(×1000)

2.3 發(fā)酵鴨肉制品蛋白質(zhì)構(gòu)象分析

2.3.1 拉曼光譜分析不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)拉曼光譜圖如圖6所示。由圖6可知，婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品和納地青霉發(fā)酵鴨肉制品中二硫鍵的出峰波數(shù)分別為537 cm-1和556 cm-1，二硫鍵在發(fā)酵鴨肉制品蛋白質(zhì)中的數(shù)量減少且結(jié)構(gòu)被破壞，而二硫鍵的斷裂會引起蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)(如蛋白活性、功能等)的改變[21]。結(jié)合發(fā)酵鴨肉制品TEM圖可知，發(fā)酵鴨肉制品肌原纖維肌節(jié)斷裂及蛋白結(jié)構(gòu)的改變可能與二硫鍵峰值的降低有關(guān)。

圖6 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)拉曼光譜圖(500～2500 cm-1)

2.3.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量如圖7所示。由圖7可知，婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對含量(40.65%)顯著低于納地青霉發(fā)酵鴨肉制品(43.02%)，但其β-折疊相對含量(29.78%)顯著高于納地青霉發(fā)酵鴨肉制品(27.33%)(P<0.05)；兩種發(fā)酵鴨肉制品的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相對含量之和變化不顯著(P>0.05)。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋減少、β-折疊增多可能與氫鍵的增加有關(guān)，這會導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性增強(qiáng)，這一結(jié)果與色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境的變化一致[22]。

圖7 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量

2.3.3 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析較高強(qiáng)度比(I760 cm-1/I1003 cm-1)的色氨酸殘基用于表示疏水環(huán)境，隨著強(qiáng)度比的降低，色氨酸殘基由疏水環(huán)境變成親水環(huán)境。酪氨酸殘基強(qiáng)度比(I850 cm-1/I830 cm-1)用于確定酪氨酸殘基是否被掩埋，當(dāng)I850 cm-1低于I830 cm-1時(shí)，表示酪氨酸殘基被掩埋在疏水環(huán)境中[23]。因此，色氨酸殘基微環(huán)境均一化強(qiáng)度(I760 cm-1/I1003 cm-1)越大，疏水性越強(qiáng)；酪氨酸殘基微環(huán)境均一化強(qiáng)度(I850 cm-1/I830 cm-1)越小，疏水性越強(qiáng)[11]。不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品中色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境均一化強(qiáng)度見表1。由表1可知，婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品中I760 cm-1/I1003 cm-1(0.713)顯著高于納地青霉制品(0.551)(P<0.05)；婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品中I850 cm-1/I830 cm-1(0.835)顯著低于納地青霉制品(0.958)(P<0.05)。這表明婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品蛋白質(zhì)的疏水性基團(tuán)更易暴露出來，從而導(dǎo)致其疏水性比納地青霉發(fā)酵鴨肉制品更強(qiáng)。

表1 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品中色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境均一化強(qiáng)度

2.4 LF-NMR分析

不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品的T2分布和T2分布積分面積分別見表2和表3，其中，T20代表結(jié)合水，T21代表不易流動水，T22代表自由水。實(shí)際上，在肉制品中，除可以完全自由移動的水分之外，其余水分均被不同程度地束縛著[24]。由表2和表3可知，納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的T20和P20均顯著小于婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品(P<0.05)，這表明納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的結(jié)合水含量顯著少于婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品。納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的T21顯著小于婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品(P<0.05)，而二者的P21變化不顯著(P>0.05)。納地青霉發(fā)酵鴨肉制品在T22時(shí)均未出峰，因而對自由水變化的參考價(jià)值不大。

表2 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品的T2分布

表3 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品的T2分布積分面積

2.5 GC-MS分析

不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)見表4。由表4可知，納地青霉發(fā)酵鴨肉制品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共51種，其中，醛類8種，烴類30種，酯類1種，酸類3種，酮類1種，醇類8種；婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共47種，其中，醛類7種，烴類28種，酯類1種，酸類3種，酮類2種，醇類6種。納地青霉發(fā)酵鴨肉制品中產(chǎn)生了新的醛類(反-2-辛烯醛)和醇類(3，7-二甲基-1-辛醇、1-十六烷醇)物質(zhì)。其中醛類物質(zhì)是呈香物質(zhì)且閾值很低，對風(fēng)味起重要作用[25]。

表4 不同霉菌發(fā)酵鴨肉制品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

3 結(jié)論

本文將婁地青霉和納地青霉分別接入滅菌處理后的鴨胸肉中，經(jīng)27 ℃前發(fā)酵7 d，30 ℃后發(fā)酵13 d制得發(fā)酵鴨肉制品，分析了兩種霉菌對發(fā)酵鴨肉制品的質(zhì)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)構(gòu)象、水分分布和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，得出如下結(jié)論：與婁地青霉鴨肉制品相比，納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的硬度更低且彈性下降更快，結(jié)合水含量較少，具有更平滑的表面；兩種發(fā)酵鴨肉制品均無肌原纖維結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋減少、β-折疊增多；納地青霉發(fā)酵鴨肉制品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較婁地青霉發(fā)酵鴨肉制品多，且產(chǎn)生了新的醛類和醇類物質(zhì)。綜上所述，納地青霉更適宜作為發(fā)酵劑用于生產(chǎn)特定風(fēng)味和質(zhì)地的新型即食發(fā)酵鴨肉制品，該結(jié)論對提升鴨肉制品的精深加工及綜合利用水平具有一定意義。