張志平，段乃心，魏湘楠，段晨陽，宋麗麗，魏濤

1.鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001

0 引言

粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)為生產(chǎn)類胡蘿卜素的主要菌種之一，其生物安全性使生產(chǎn)的類胡蘿卜素可用作天然食品著色劑和水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑[4-5]。影響粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的外部培養(yǎng)因素包括溫度、pH值、通氣量等[4-6]，營養(yǎng)因素包括碳源、氮源、無機鹽等[7-8]。已有文獻[9-10]報道，以葡萄糖為碳源時，非生物可控光脅迫因子能顯著提高菌體生長率和類胡蘿卜素產(chǎn)量，主要原因是光脅迫可顯著上調(diào)類胡蘿卜素生物合成途徑的相關基因表達，而類胡蘿卜素的過度積累是細胞抵抗輻射引起活性氧(ROS)損傷的重要保護機制，表明粘紅酵母具有抗氧化應激相關生理代謝能力[10]。粘紅酵母的碳源來源廣，有機廢水中的揮發(fā)性有機酸、生物柴油副產(chǎn)物粗甘油、啤酒廠廢水中的麥芽糖等均可作為粘紅酵母發(fā)酵用碳源，但光脅迫對粘紅酵母生物轉(zhuǎn)化上述廉價碳源的影響效果尚缺少系統(tǒng)性評價。

基于此，為降低微生物類胡蘿卜素發(fā)酵原料成本，有效提高粘紅酵母類胡蘿卜素合成速率和產(chǎn)量，本文擬設置非生物可控光脅迫條件，考查粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的最佳碳源、氮源、初始pH值和培養(yǎng)溫度，并進一步采用正交試驗優(yōu)化粘紅酵母合成類胡蘿卜素的發(fā)酵條件，以期為資源化利用可再生有機廢棄物生產(chǎn)微生物高值化類胡蘿卜素提供技術支持和參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

粘紅酵母，購于中國食品工業(yè)發(fā)酵研究所，經(jīng)鄭州輕工業(yè)大學實驗室誘變篩選后，于4 ℃條件下保存于YPD固體培養(yǎng)基中。

1.2 主要試劑

葡萄糖、牛肉膏、乙酸鈉、甘油、蔗糖、NaOH、(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4·7H2O、NaNO3、NaNO2，北京博奧星生物科技有限責任公司產(chǎn)；酵母粉，英國Oxoid公司產(chǎn)；無水乙醇，津東天正精細化學品試劑廠產(chǎn)。以上化學試劑均為分析純。

1.3 主要儀器與設備

Agilent 1260型高效液相色譜儀，配有Zorbax EclipsePlus C18柱(150 mm×4.6 mm×5 μm),安捷倫科技(中國)有限公司產(chǎn)；5 L發(fā)酵罐，德國賽多利斯公司產(chǎn)；XRP-3000型數(shù)字式照度計，美國Spectronics公司產(chǎn)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產(chǎn)；LIDA PHS-3C型pH計，上海理達儀器廠產(chǎn)；THZ-100型恒溫振蕩搖床，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)；LX-C50型立式自動滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療設備有限公司產(chǎn)；ME204E型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)；HH-S4水浴鍋，上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)；T700型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)；T5LED型燈管，南京亞丹照明科技有限公司產(chǎn)；TDZ5-WS型臺式低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)。

1.4 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

基礎培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，KH2PO47 g，(NH4)2SO42 g，Na2SO42 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，酵母粉1.5 g，調(diào)pH值至5.5，加水定容至1000 mL，于116 ℃滅菌25 min。常規(guī)搖瓶培養(yǎng)溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為220 r/min。250 mL搖瓶裝液量為100 mL，接種量為10%。

5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：以正交試驗確定的最佳發(fā)酵條件配制培養(yǎng)基，設置最佳培養(yǎng)參數(shù)條件進行5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，裝液量為4 L，接種量為10%，通氣量為4 L/min，攪拌槳轉(zhuǎn)速為300 r/min，外置5000 Lux的LED光源。

由表5可以看出，第1期CPI對自身變動的貢獻率為51.6%，至第11期之后趨于平穩(wěn)，穩(wěn)定在40.6%左右；第1期農(nóng)產(chǎn)品價格對CPI的變動貢獻率為48.4%，在第11期趨于平穩(wěn)，穩(wěn)定在59.4%左右。

1.5 實驗方法

1.5.1 光脅迫對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響菌種活化后，重新按接種量10%轉(zhuǎn)接于基礎培養(yǎng)基搖瓶中。為嘗試開發(fā)利用日光照射培養(yǎng)粘紅酵母的工藝，采用模擬日光的強度(5000 Lux)作為光脅迫條件，設置暗培養(yǎng)為對照組，于30 ℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，比較光脅迫對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響。

1.5.2 單因素試驗設計1)最佳碳源的確定：分別選擇葡萄糖、乙酸鈉、甘油和蔗糖為基礎培養(yǎng)基的唯一碳源，初始質(zhì)量濃度均為20 g/L，于30 ℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，比較不同碳源對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響。

2)最佳氮源的確定：分別選擇3種無機氮源((NH4)2SO4、NaNO3和NaNO2)和3種有機氮源(酵母粉、牛肉膏和蛋白胨)代替基礎培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4和酵母粉，初始質(zhì)量濃度均為3.5 g/L，于30 ℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，比較不同氮源對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響。

3)最佳初始pH值的確定：分別將基礎培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)為4.0、5.0、6.0，于30 ℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，比較不同初始pH值對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響。

4)最佳培養(yǎng)溫度的確定：分別于25 ℃、30 ℃和37 ℃條件下采用基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)粘紅酵母，比較不同溫度對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響。

1.5.3 正交試驗設計在單因素試驗的基礎上，以類胡蘿卜素產(chǎn)量為指標，設置光照強度為5000 Lux，選取碳源(20 g/L，A)、氮源(3.5 g/L，B)、初始pH值(C)、培養(yǎng)溫度(D)為主要影響因素，設計L9(34)正交試驗，其因素與水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素與水平

1.5.4 生物量測定取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，于5000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄上清液，用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的NaCl溶液懸浮菌體，重復離心1次。用去離子水稀釋菌懸液100倍，采用紫外可見分光光度計測定600 nm處吸光度，按式①(R2=0.998)計算發(fā)酵液的生物量：

W=100×(0.889 9×A600-0.042 05)

①

式中，W為生物量/(g·L-1)；100為稀釋倍數(shù)；A600為樣品在600 nm處吸光度。

1.5.5 類胡蘿卜素測定1)類胡蘿卜素含量和產(chǎn)量測定。參考朱麗花等[1]的方法，略作調(diào)整。取2 mL發(fā)酵液，以5000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，收集菌體，并用蒸餾水懸浮菌體再離心，加入6 mL HCl溶液(3 mol/L)振蕩懸浮菌體，沸水浴靜置5 min后迅速冷卻，以5000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，棄上清液，加入6 mL石油醚與丙酮的等體積混合溶液，振蕩提取類胡蘿卜素，離心后適當稀釋，即得類胡蘿卜素提取液。測定其475 nm處吸光度，按式②和③分別計算類胡蘿卜素含量/(μg·g-1)和產(chǎn)量/(μg·L-1)：

類胡蘿卜素含量=A475×D×V/(0.16×W)

②

類胡蘿卜素產(chǎn)量= 類胡蘿卜素含量×W

③

式中，A475為樣品在475 nm處吸光度；V為消耗有機溶劑的總體積/mL；D為測量吸光度時的溶液稀釋倍數(shù)；0.16為類胡蘿卜素消光系數(shù)。

2)類胡蘿卜素種類測定。采用反向高效液相色譜法測定類胡蘿卜素種類，具體方法為：用1 mL醫(yī)用注射器吸取類胡蘿卜素提取液1 mL，有機相濾膜(0.22 μm)過濾后，將濾液置于2 mL上樣瓶中，于4 ℃冰箱保存待測。測定條件如下：分析柱為Zorbax EclipsePlus C18柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)，流動相為體積分數(shù)為95%的甲醇溶液，流速為1 mL/min，柱溫為45 ℃，檢測波長為450 nm，依據(jù)每種類胡蘿卜素標準品的出峰時間和保留峰面積分別進行定性和定量分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

每個樣品的測定指標至少平行測定3次，采用正交設計助手Ⅱ v3.1軟件作極差和方差分析，利用Origin9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 光脅迫對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響分析

光脅迫作為一種刺激因子，可影響含色素類菌株產(chǎn)生細胞生理代謝應激反應，進而影響細胞生長和產(chǎn)物合成[10]。光脅迫對粘紅酵母生長速率、生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1所示。由圖1可以看出，當以葡萄糖(20 g/L)為碳源時，光脅迫可提高粘紅酵母生長速率、生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量。光照組和對照組的最大生物量分別為11.4 g/L(144 h)和9.4 g/L(168 h)，光照組的最大生物量比對照組提高了21.3%，且培養(yǎng)時間縮短了24 h，表明光脅迫可提高粘紅酵母生長速率和總生物量。這可能是因為光照可顯著上調(diào)細胞內(nèi)糖酵解途徑(EMP途徑)和三羧酸(TCA)循環(huán)的相關基因表達，而TCA循環(huán)的激活可促進氨基酸合成和細胞的快速生長[11]。從類胡蘿卜素含量和產(chǎn)量變化趨勢可以看出，光照組和對照組的最大類胡蘿卜素含量均出現(xiàn)在菌體對數(shù)生長中期；而兩者的最大類胡蘿卜素產(chǎn)量均出現(xiàn)在對數(shù)生長末期，分別為14.3 mg/L(96 h)和9.9 mg/L(120 h)，光照組的類胡蘿卜素產(chǎn)量比對照組提高了44.4%。在培養(yǎng)基營養(yǎng)比例適當時，光刺激可激活細胞產(chǎn)生對輻射損傷ROS的保護機制。一方面，合成多碳長鏈多烯類化合物類胡蘿卜素的相關生物合成途徑基因上調(diào)，如用于合成類帖、類固醇等生物分子合成前體的甲羥戊酸(MVA)途徑的相關基因上調(diào)，特別是將焦磷酸(GGPP)轉(zhuǎn)化為類胡蘿卜素的反應為產(chǎn)色素酵母類所獨有[12]；另一方面，磷酸戊糖途徑(PPP)、蘋果酸脫氫酶(ME)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)等相關基因上調(diào)使細胞合成大量的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，為類胡蘿卜素的生物合成提供了還原力[10]。物質(zhì)和能量代謝促使粘紅酵母通過非酶(類胡蘿卜素、谷胱甘肽和類黃酮)系統(tǒng)抵抗氧化應激。當細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，由于培養(yǎng)基中碳源與氮源比例失調(diào)，細胞代謝流會優(yōu)先用于細胞生長，因而造成類胡蘿卜素含量下降；由于培養(yǎng)體系生物量的持續(xù)增加，類胡蘿卜素產(chǎn)量在細胞對數(shù)生長中后期也隨之提高。

圖1 光脅迫對粘紅酵母生長速率、生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 光脅迫下碳源對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響分析基于適當強度光照可顯著促進粘紅酵母生長和產(chǎn)物合成，后續(xù)發(fā)酵工藝體系的優(yōu)化過程需要給予模擬日光照射。已有文獻[13-15]報道，粘紅酵母可利用葡萄糖、乙酸鈉、甘油和麥芽糖作為碳源進行生長，除葡萄糖為廣譜性碳源之外，其他3種碳源均可從廢棄生物質(zhì)原料中獲得。其中，乙酸鈉一般為工業(yè)有機廢水酸化后形成，甘油為食品加工或生物柴油催化過程形成的副產(chǎn)物，麥芽糖則主要來源于啤酒廠廢水。

外置5000 Lux光脅迫條件下，不同碳源對粘紅酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖2所示。由圖2a)可以看出，葡萄糖組、甘油組和乙酸鈉組的最大生物量分別為11.5 g/L、9.3 g/L和5.6 g/L，麥芽糖組的生物量幾乎沒有變化，表明光脅迫條件下，粘紅酵母能以葡萄糖、甘油和乙酸鈉作為唯一碳源，而不能以麥芽糖作為唯一碳源。這可能是因為甘油和乙酸鈉可通過簡單擴散的方式進入細胞而被代謝為具有和其他糖類相同生產(chǎn)力的底物[7]，麥芽糖的利用則需要通過水解措施或使用具有降解該糖的菌株來實現(xiàn)[15]。由圖2b)可以看出，粘紅酵母能夠利用的這3種碳源均可有效合成類胡蘿卜素，且葡萄糖組、甘油組和乙酸鈉組對應的最大類胡蘿卜素產(chǎn)量分別為14.2 mg/L(96 h)、8.7 mg/L(120 h)和9.3 mg/L(216 h)，乙酸鈉組中的類胡蘿卜素產(chǎn)量在發(fā)酵后期(168 h)超過了甘油組，這表明后續(xù)利用上述3種碳源合成類胡蘿卜素時需要考慮發(fā)酵周期。

圖2 不同碳源對粘紅酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

2.2.2 光脅迫下氮源對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響分析為了更全面地考查粘紅酵母對無機氮源和有機氮源的利用情況，選擇酵母粉、牛肉膏和蛋白胨作為有機氮源，銨根鹽、硝酸根鹽和亞硝酸根鹽作為無機氮源，初始質(zhì)量濃度均為3.5 g/L，培養(yǎng)至192 h。不同氮源對粘紅酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖3所示。由圖3可以看出，有機氮源由于營養(yǎng)成分復雜，除能給微生物提供氮源(有機大分子蛋白質(zhì)、小分子多肽和游離單體氨基酸)之外，還可以提供生長因子、維生素、微量元素等物質(zhì)，因此，其培養(yǎng)組的生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量均較高，表明該菌具有資源化利用含蛋白氨基酸類有機廢水的潛力；無機氮源也能被粘紅酵母利用，但該菌對銨根鹽的利用情況明顯優(yōu)于硝酸根鹽和亞硝酸根鹽?？紤]到無機氮源和有機氮源相結合具有協(xié)同增效的效果，因此選用(NH4)2SO4、酵母粉和牛肉膏作為后續(xù)發(fā)酵用復配氮源。

圖3 不同氮源對粘紅酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

2.2.3 光脅迫下初始pH值對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響分析粘紅酵母在pH值為4.0～7.0的條件下均可以生長，然而培養(yǎng)基初始pH值的不同會影響菌體對基質(zhì)的利用速度，進而影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成速率[16]。不同初始pH值對粘紅酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖4所示。由圖4a)可以看出，雖然初始培養(yǎng)基pH值不同，但整個培養(yǎng)體系的pH值均隨發(fā)酵時間的延長而降低。這可能是因為，一方面隨著菌體進入對數(shù)生長期，發(fā)酵體系溶氧下降，酵母進行無氧呼吸產(chǎn)酸，致使整個培養(yǎng)體系的pH值下降[17]；另一方面，當培養(yǎng)基碳源與氮源比例失調(diào)且有機氮源被細胞利用后，也會造成培養(yǎng)體系的pH值下降[18]。選取生物量均達到最大值時的培養(yǎng)時間(168 h)取樣測定各培養(yǎng)組參數(shù)，結果如圖4b)所示。由圖4b)可知，當初始pH值為6.0時，可獲得最大生物量(12.4 g/L)；當初始pH值為5.0時，可獲得最大類胡蘿卜素產(chǎn)量(14.5 mg/L)。綜上所述，選擇初始pH值為5.0～6.0進行下一步試驗。

圖4 不同初始pH值對培養(yǎng)體系pH值、粘紅酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

2.2.4 光脅迫下培養(yǎng)溫度對粘紅酵母生長和類胡蘿卜素合成的影響分析溫度是直接影響微生物生長速率的重要物理因素之一，其主要通過影響酶的表達和活性進而影響類胡蘿卜素的合成[19]。不同培養(yǎng)溫度對粘紅酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖5所示。由圖5可以看出，在37 ℃條件下，粘紅酵母幾乎停止生長；在25 ℃和30 ℃條件下，粘紅酵母的生長情況及類胡蘿卜素產(chǎn)量均表現(xiàn)良好，其中25 ℃為最佳培養(yǎng)溫度，在該培養(yǎng)溫度下的最大生物量為12.4 g/L(192 h)，最大類胡蘿卜素產(chǎn)量為15.33 mg/L(120 h)，表明后續(xù)工藝優(yōu)化可選擇的培養(yǎng)溫度為25～30 ℃。

圖5 不同培養(yǎng)溫度對粘紅酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

2.3 正交試驗結果分析

粘紅酵母發(fā)酵條件正交試驗結果見表2。由表2可知，以類胡蘿卜素產(chǎn)量為指標，各因素的主次關系為碳源(A)>初始pH值(C)>氮源(B)>培養(yǎng)溫度(D)。因此，光脅迫條件下，碳源種類的選擇為影響類胡蘿卜素產(chǎn)量的主要因素，以甘油為最佳，其次為葡萄糖，表明粘紅酵母可高效利用生物柴油主要副產(chǎn)物甘油合成類胡蘿卜素。根據(jù)極差分析結果，確定粘紅酵母的最佳發(fā)酵條件為：20 g/L的甘油為碳源，3.5 g/L的酵母粉為氮源，初始pH值為5.0，培養(yǎng)溫度為25 ℃，其他無機鹽和微量元素與基礎培養(yǎng)基一致。經(jīng)5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)后，獲得的最大生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量分別為14.2 g/L和17.3 mg/L，與優(yōu)化前(11.4 g/L和14.3 mg/L)相比，生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量分別提高了24.5%和21.0%。

表2 粘紅酵母發(fā)酵條件正交試驗結果

2.4 光脅迫下粘紅酵母合成類胡蘿卜素種類和含量分析

光脅迫下粘紅酵母合成類胡蘿卜素種類及含量見表3。由表3可知，光照組和對照組均可合成3種類胡蘿卜素，分別為β-類胡蘿卜素、紅酵母紅素和圓酵母素。光脅迫除影響類胡蘿卜素產(chǎn)量外，還將紅酵母紅素和圓酵母素在類胡蘿卜素中的占比由21.7%提高到40.6%。這可能是因為紅酵母紅素和圓酵母素是粘紅酵母抵抗逆境的主要途徑，粘紅酵母通過選擇性調(diào)控某些關鍵基因的表達，改變具有抗逆效果的色素合成途徑，賦予細胞應激反應的能力，以響應環(huán)境的光脅迫[20]。相較于β-類胡蘿卜素，紅酵母紅素和圓酵母素具有更高的市場價值，即光脅迫可有效提升粘紅酵母合成類胡蘿卜素的產(chǎn)品價值。

表3 光脅迫下粘紅酵母合成類胡蘿卜素種類及含量

3 結論

本文設置了模擬日光照射(5000 Lux)的光脅迫條件，優(yōu)化了粘紅酵母合成類胡蘿卜素的發(fā)酵條件，得到最佳發(fā)酵條件為甘油質(zhì)量濃度20 g/L、酵母粉質(zhì)量濃度3.5 g/L、初始pH值5.0、培養(yǎng)溫度25 ℃，其他無機鹽和微量元素與基礎培養(yǎng)基一致，在此條件下，經(jīng)5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)結束后，粘紅酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量比對照組分別提高了24.5%和21.0%。光脅迫條件下，高附加值類胡蘿卜素(紅酵母紅素和圓酵母素)占比由對照組的21.7%提高到40.6%。后續(xù)研究可選取廉價、易得的工農(nóng)業(yè)有機廢棄物作為發(fā)酵原料，開發(fā)基于日光周期控制的工藝手段，在有效降低微生物類胡蘿卜素發(fā)酵成本的基礎上，提高類胡蘿卜素的產(chǎn)品價值和市場競爭力。