魯建央 魯才娟 詹欣 吳雅楓 翟洪波

羊膜腔穿刺術(shù)是最常用的有創(chuàng)性胎兒取材技術(shù)，通過(guò)獲取羊水細(xì)胞行細(xì)胞或分子遺傳學(xué)檢測(cè)，通常在孕16～24周進(jìn)行，便于孕婦28周之前作出是否繼續(xù)妊娠的決定。新基因組時(shí)代，染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis,CMA）是胎兒結(jié)構(gòu)異常的首選分子遺傳學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)比傳統(tǒng)的核型分析，CMA額外增加6%的拷貝數(shù)變異（copy number variants,CNVs）檢出率[1]。鑒于CMA的高分辨率，臨床意義不明的拷貝數(shù)變異（variants of uncertain clinical significance,VUS）檢出率也隨之增加[2]，給產(chǎn)前遺傳咨詢(xún)?cè)鎏聿簧匐y度。本研究回顧性分析孕晚期選擇羊膜腔穿刺的280例胎兒資料，探討其指征、穿刺并發(fā)癥、遺傳學(xué)結(jié)果及妊娠結(jié)局，為孕晚期超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒異常患者的咨詢(xún)及產(chǎn)前診斷方法的選擇提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2017年1月至2021年1月孕28周之后超聲發(fā)現(xiàn)胎兒異常，至浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科，經(jīng)遺傳咨詢(xún)后行羊膜腔穿刺的280例胎兒資料。孕婦年齡18～43（29.43±4.50）歲，孕周28～34（29.14±2.52）周。對(duì)高度懷疑單基因遺傳病的胎兒行家系全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing,WES）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕周28～33+6周；（2）符合介入性產(chǎn)前診斷指征，且獲得孕婦知情同意；（3）夫妻雙方年齡≥18周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕周＜28周；（2）符合介入性產(chǎn)前診斷指征，但孕婦選擇臍血穿刺。產(chǎn)前超聲異常包括超聲結(jié)構(gòu)畸形及非結(jié)構(gòu)異常[3]。超聲結(jié)構(gòu)畸形包括：（1）神經(jīng)系統(tǒng)畸形；（2）頭面部畸形；（3）呼吸系統(tǒng)畸形；（4）心血管系統(tǒng)畸形；（5）腹壁畸形；（6）消化系統(tǒng)畸形；（7）泌尿系統(tǒng)畸形；（8）骨骼系統(tǒng)畸形；（9）其他畸形（胎兒水腫及腫瘤）。非結(jié)構(gòu)異常包括：（1）軟指標(biāo)陽(yáng)性；（2）胎兒生長(zhǎng)發(fā)育受限；（3）羊水量異常。所有胎兒父母均接受產(chǎn)前遺傳咨詢(xún)、簽署知情同意書(shū)，并同意將所得數(shù)據(jù)用于本研究。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 在超聲實(shí)時(shí)引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水10 ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA提取及CMA分析 按照德國(guó)凱杰QIAamp DNA Blood mini kit（Qiagen）說(shuō)明書(shū)提取羊水基因組DNA。采用單核苷酸多態(tài)性微陣列（SNP array）檢測(cè)平臺(tái)（Affymetrix），基于CytoScan750K Array芯片進(jìn)行全基因組CNVs檢測(cè)。Chas 3.0軟件進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)的分析，以≥50個(gè)探針標(biāo)記，≥100 kb的分辨率用于分析基因組CNVs。

1.2.3 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3）基因檢測(cè) 采用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)胎兒FGFR3基因c.1138G＞A/C位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，明確胎兒是否攜帶該熱點(diǎn)致病突變，陽(yáng)性結(jié)果重復(fù)驗(yàn)證。

1.2.4 家系WES檢測(cè) 對(duì)高度懷疑單基因遺傳病的胎兒，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)22 000個(gè)基因的外顯子，對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變采用Sanger測(cè)序進(jìn)行位點(diǎn)驗(yàn)證及家系驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 孕晚期羊膜腔穿刺的指征分析 孕晚期羊膜腔穿刺的主要指征是超聲異常266例（95.0%），其中位于前3位的是神經(jīng)系統(tǒng)異常73例（27.4%）、泌尿系統(tǒng)異常57例（21.4%）、股骨短小32例（12.0%）。除超聲異常外的指征有14例（5.0%），詳見(jiàn)表1。

表1 孕晚期羊膜腔穿刺的指征分析

2.2 孕晚期羊膜腔穿刺的并發(fā)癥分析 孕晚期羊膜腔穿刺后發(fā)現(xiàn)胎死宮內(nèi)2例（0.7%）；早產(chǎn)3例（1.1%），其中1例穿刺操作后11 d早產(chǎn)，分娩前未得到CMA結(jié)果，詳見(jiàn)表2。

表2 孕晚期羊膜腔穿刺的并發(fā)癥分析

2.3 分子遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果與妊娠結(jié)局

2.3.1 染色體畸變與妊娠結(jié)局 共檢出18例染色體畸變，檢出率為6.4%。其中致病性或可疑致病CNVs 14例，其他染色體異常4例（包括18三體1例、單親二倍體2例、46，XY/47，XYY 嵌合體1例）。除外1例性染色體嵌合，17例（94.4%）染色體畸變胎兒的孕婦選擇優(yōu)生引產(chǎn)，見(jiàn)表3。

表3 18例染色體畸變結(jié)果與妊娠結(jié)局

2.3.2 VUS與妊娠結(jié)局 共檢出19例VUS，檢出率為6.8%，其中雜合性缺失2例。13例（68.4%）選擇驗(yàn)證親代來(lái)源，其中12例遺傳自父親或母親，僅1例為新發(fā)變異。最終胎死宮內(nèi)及早產(chǎn)各1例；因胎兒結(jié)構(gòu)畸形選擇優(yōu)生引產(chǎn)4例；活產(chǎn)13例，其中1例產(chǎn)前提示側(cè)腦室增寬，產(chǎn)后因特殊面容、多毛、連眉、發(fā)育遲緩，基因檢測(cè)確診“德朗熱綜合征”，余12例活產(chǎn)兒隨訪(fǎng)情況見(jiàn)表4。

表4 19例VUS與妊娠結(jié)局

2.3.3 單基因遺傳病 共檢出單基因遺傳病胎兒7例，檢出率為2.5%，選擇優(yōu)生引產(chǎn)6例，雙胎減胎術(shù)1例。5例因股骨短小行CMA+FGFR3基因c.1138G＞A/C位點(diǎn)檢測(cè)，均為FGFR3基因c.1138G>A雜合突變，診斷“軟骨發(fā)育不全”。1例孕29+3周超聲提示心臟多發(fā)橫紋肌瘤，羊水CMA+WES檢測(cè)提示TSC2基因錯(cuò)義突變。1例孕28周超聲提示側(cè)腦室前角增寬0.6 cm，側(cè)腦室后角1.0 cm，MRI提示側(cè)腦室陳舊性出血，孕婦2014年因“胎兒宮內(nèi)窘迫”剖宮產(chǎn)一女?huà)耄ㄘ舱郏?，訴有腦室增寬，2016年因“胎兒水腫”引產(chǎn)，結(jié)合病史，行CMA+WES檢測(cè)，結(jié)果提示JAM3基因c.712+2T＞A與c.813C＞G復(fù)合雜合致病性突變，分別遺傳自父親與母親。

3 討論

本研究顯示超聲結(jié)構(gòu)異常是孕晚期羊膜腔穿刺最主要的指征，占95.0%，前3位的分別是神經(jīng)系統(tǒng)異常（27.4%）、泌尿系統(tǒng)異常（21.4%）及股骨短小（12.0%）。胎兒發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展的過(guò)程，部分遲發(fā)畸形在妊娠晚期才表現(xiàn)出來(lái)[4]。Yinon等[5]報(bào)道47例＜孕24周大排畸超聲正常、但孕晚期診斷神經(jīng)系統(tǒng)異常的胎兒，診斷孕齡中位數(shù)31.1周。Melcer等[6]研究57例＞24周因神經(jīng)系統(tǒng)異常引產(chǎn)的胎兒資料后得出結(jié)論：即使常規(guī)產(chǎn)檢，39%的神經(jīng)系統(tǒng)異常胎兒在妊娠晚期才可能被檢出。本研究中最常見(jiàn)的胎兒結(jié)構(gòu)異常是神經(jīng)系統(tǒng)異常，與胎兒發(fā)育的特點(diǎn)以及文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。Yi等[7]報(bào)道了943例側(cè)腦室增寬的胎兒診斷孕周為（23.8±8.2）周。除超聲結(jié)構(gòu)異常外，部分孕婦因害怕恐懼流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)而主動(dòng)選擇孕晚期介入性產(chǎn)前診斷[8]。對(duì)錯(cuò)過(guò)羊膜腔最佳穿刺孕周的孕婦，一般建議臍靜脈穿刺，但該操作母胎損傷風(fēng)險(xiǎn)較大，技術(shù)要求高，存在胎兒丟失、穿刺失敗、胎盤(pán)出血、胎心過(guò)緩、臍帶血腫等[9]。國(guó)內(nèi)關(guān)于晚期羊膜腔穿刺的研究較少提到相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率[10-12]。本研究280例晚期羊膜腔穿刺后早產(chǎn)3例，發(fā)生率1.1%，低于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道（5.7%～6.6%）[13-14]。為降低早產(chǎn)兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)病率，晚期羊膜腔穿刺前是否使用糖皮質(zhì)激素仍未有定論[15]。多數(shù)研究認(rèn)為中孕期單胎羊膜腔穿刺后胎兒丟失率＜0.5%[14,16]。本研究中胎死宮內(nèi)2例，發(fā)生率0.7%，略高于Daum等[13]報(bào)道的0.6%。孕晚期羊膜腔穿刺與中孕期相比是否增加胎兒丟失率，仍需更多高質(zhì)量的研究探討。

本研究應(yīng)用CMA檢出14例致病或可疑致病CNVs，4例其他染色體異常，染色體畸變檢出率為6.4%。筆者還通過(guò)WES和FGFR3基因熱點(diǎn)突變檢測(cè)檢出了7例單基因遺傳病，檢出率為2.5%。對(duì)孕晚期超聲提示胎兒股骨生長(zhǎng)停滯或彎曲的患者，選擇FGFR3基因熱點(diǎn)突變檢測(cè)有助于提高軟骨發(fā)育不全的基因診斷率[17]，且報(bào)告周期較短，可減少孕婦及家屬等待報(bào)告的時(shí)間。研究報(bào)道即使應(yīng)用CMA技術(shù)，超過(guò)60%結(jié)構(gòu)畸形胎兒的病因仍不明確[18]。WES技術(shù)用于胎兒結(jié)構(gòu)畸形的病因?qū)W研究是目前的熱點(diǎn)，在核型和CMA檢測(cè)陰性時(shí)，WES增加8.5%～19.0%的致病性基因變異檢出率[18-20]。這些致病性基因變異更常見(jiàn)于胎兒心臟畸形、骨骼系統(tǒng)畸形、淋巴水囊瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形和腎臟畸形。2020年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)建議，對(duì)產(chǎn)前超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒，核型和CMA檢測(cè)陰性時(shí)，可考慮WES檢測(cè)[21]。本研究2例應(yīng)用WES技術(shù)案例，均在發(fā)現(xiàn)胎兒畸形后數(shù)天選擇優(yōu)生引產(chǎn)，因此報(bào)告周期的壓力較小。1例WES結(jié)果提示結(jié)節(jié)性硬化，這是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)皮膚綜合征，臨床表型包括：癲癇發(fā)作和智力減退、面部皮脂腺瘤等，胎兒期主要表現(xiàn)為心臟橫紋肌瘤[22]。1例WES結(jié)果提示JAM3基因復(fù)合雜合致病性變異，可導(dǎo)致出血性腦損傷、室管膜下鈣化和白內(nèi)障，是一種嚴(yán)重的常染色體隱性遺傳疾病[23]。臨床上，由于WES檢測(cè)費(fèi)用高昂，報(bào)告周期較長(zhǎng)，胎兒宮內(nèi)表型的限制性及結(jié)果解釋的復(fù)雜性，產(chǎn)前診斷領(lǐng)域尚未全面推廣，仍需更多高質(zhì)量的臨床研究。

VUS是指人群中不常見(jiàn)的CNVs，沒(méi)有或很少量的證據(jù)可用來(lái)評(píng)估臨床致病性。VUS因臨床表型的不確定性，可能增加孕婦的焦慮壓力，難以作出是否繼續(xù)妊娠的抉擇。VUS的檢出受檢測(cè)平臺(tái)、檢測(cè)指征、報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)等因素影響，文獻(xiàn)報(bào)道檢出率為1.4%～12.3%[24-27]。本研究VUS檢出率為6.8%，與既往研究基本一致。產(chǎn)前咨詢(xún)中，建議孕婦驗(yàn)證VUS來(lái)源非常重要，這影響著孕婦是否繼續(xù)妊娠的決定。Chen等[28]發(fā)現(xiàn)拒絕驗(yàn)證VUS來(lái)源的孕婦與驗(yàn)證組相比，更傾向選擇引產(chǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩組不良妊娠結(jié)局發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于胎兒表型限制性，VUS的產(chǎn)前咨詢(xún)是個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。通常遺傳自表型正常父母的CNVs筆者認(rèn)為胎兒出現(xiàn)臨床表型的概率較小，屬于家族性良性變異可能性較大。CNVs的大小、內(nèi)含的基因、遺傳模式等有助于辨別更偏向良性還是致病性。然而一些CNVs具有表現(xiàn)度及外顯率差異，即使父母表型正常，也不能預(yù)測(cè)胎兒的臨床結(jié)局[27]。建議由經(jīng)驗(yàn)豐富的專(zhuān)家針對(duì)VUS進(jìn)行咨詢(xún)，并能提前查閱數(shù)據(jù)庫(kù)，跟胎兒父母詳細(xì)解釋數(shù)據(jù)庫(kù)中基因型表型的相關(guān)性[1]，避免盲目引產(chǎn)。VUS胎兒分娩后，仍需兒科隨訪(fǎng)，觀(guān)察是否出現(xiàn)相應(yīng)疾病癥狀以便及時(shí)診治。

本研究回顧分析了280例孕晚期因胎兒異常行羊膜腔穿刺的資料，發(fā)現(xiàn)超聲結(jié)構(gòu)異常是最主要的穿刺指征；晚期羊膜腔穿刺術(shù)后早產(chǎn)發(fā)生率1.1%，胎死宮內(nèi)發(fā)生率0.7%，染色體畸變檢出率6.4%，VUS檢出率6.8%，CMA基礎(chǔ)上應(yīng)用WES技術(shù)有助于提高陽(yáng)性檢出率。本研究結(jié)果為孕晚期超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒的產(chǎn)前診斷提供了一定的臨床參考價(jià)值，對(duì)害怕臍血穿刺的孕婦，可考慮晚期羊膜腔穿刺。本研究的不足之處在于，研究對(duì)象進(jìn)行了羊水CMA檢測(cè)，未做羊水細(xì)胞培養(yǎng)，將在后續(xù)的工作中探索孕晚期羊水細(xì)胞培養(yǎng)的條件及成功率。