張彬 徐明 賈旭錦 王盧莎 陳漫漫

慢性鼻竇炎（chronic rhinosinusitis,CRS）是一種常見的病程超過12周的累及鼻腔、鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病，多中心流行病學調查顯示我國CRS的總體患病率為4.8%～9.7%，對患者生活質量及社會經濟都造成嚴重影響[1]。CRS根據鼻黏膜組織內嗜酸粒細胞浸潤程度不同分為嗜酸粒細胞性CRS（eosinophilic CRS,ECRS）及非嗜酸粒細胞性CRS（non-eosinophilic CRS,nECRS）[2]。與 nECRS患者相比，ECRS患者往往伴有更嚴重的疾病和較差的治療結果[3]。ECRS患者血液和組織中嗜酸粒細胞增多，并表現(xiàn)出顯著的嗜酸粒細胞性炎癥[4]。因此，如何在CRS內在表型研究的基礎上，闡明CRS發(fā)病的分子機制，進而阻斷其發(fā)病機制，開展精準醫(yī)療，提高療效，成為鼻科醫(yī)生面臨的緊迫任務。但至今CRS的發(fā)病機制仍不明確，且不同內在表型CRS的發(fā)病機制也不盡相同。筆者團隊既往研究發(fā)現(xiàn)ECRS與吸煙呈正相關[5-6]，但是吸煙促進ECRS發(fā)生、發(fā)展的機制尚不明確。因此，本研究主要通過原代鼻黏膜上皮細胞（nasal epithelial cells,NEC）模型探討煙堿促進CRS患者鼻黏膜炎癥變化的機制。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019年7至12月在寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院的CRS患者16例，其中男12例，女4例；年齡21～67（42.38±12.74）歲。所有患者既往均無哮喘病史。納入標準：（1）有以下2種或2種以上癥狀：鼻阻塞、流涕或鼻涕倒流、頭暈頭痛、嗅覺減退或障礙，持續(xù)3個月以上；（2）鼻內鏡檢查雙側中鼻道有息肉樣組織，來源于鼻道竇口復合體或竇內黏膜。排除標準：鼻竇炎急性感染期、后鼻孔息肉、息肉內有纖維囊泡病變、真菌性鼻竇炎伴息肉以及纖毛不動綜合征。本研究經寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)液 DMEM培養(yǎng)基、胰酶、BEGM培養(yǎng)液及FBS均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；人IL-3、IL-5及 IL-8 ELISA Kit、人嗜酸粒細胞趨化蛋白 2（eosinophil chemotactic protein 2,eotaxin-2）ELISA Kit及人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）ELISA Kit等購自上海麥克林生化科技有限公司；CCK-8 ELISA Kit購自和元生物技術（上海）股份有限公司。Multiskan FC酶標儀購自上海騰名生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NEC原代培養(yǎng) 將新鮮CRS患者鉤突黏膜組織樣本放入含雙抗（100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）4℃無菌的PBS中沖洗3遍，10 min/次，置于DMEM培養(yǎng)基（含2 mg/ml膠原酶Ⅳ）中，4℃消化1.5 h，PBS終止消化后30 μm細胞篩網分離上皮細胞，1 000 r/min離心5 min收集上皮細胞，用加有抗生素的BEGM培養(yǎng)液重懸細胞，細胞懸液移入塑料培養(yǎng)皿中37℃孵育1 h，用貼壁法移除成纖維細胞，收獲的NEC轉入細胞培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。

1.3.2 細胞存活率檢測 采用CCK-8法。將NEC接種到96孔板中（1 500個細胞/孔），待細胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，加入含有不同濃度煙堿（10、20、40和80 μg/ml）的培養(yǎng)基培養(yǎng)，未添加煙堿的96孔細胞培養(yǎng)板為對照組，分別培養(yǎng)3、5 d后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。以未添加煙堿的單純培養(yǎng)基為空白組，采用酶標儀測定波長450 nm處吸光度（A）值，細胞存活率=[（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）]×100%。

1.3.3 NEC細胞因子IL-3、IL-5、IL-8、eotaxin-2、GMCSF表達水平檢測 采用ELISA法。NEC在含有不同濃度煙堿（10、20、40和80 μg/ml）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1、3、5 d后收集上清液。按試劑盒說明書操作步驟檢測上清液中IL-3、IL-5、IL-8、eotaxin-2、GM-CSF表達水平。

1.3.4 NEC表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）和蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。將NEC接種至6孔板中，按上述干預方法加入煙堿進行干預，干預結束后，棄細胞上清液，PBS清洗2遍，每孔中加入100 μl RIPA裂解液裂解細胞提取總蛋白。BCA蛋白定量法確定并調整蛋白濃度，20 μg蛋白在SDS-PAGE中電泳，通過濕轉法，將蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉+TBST配置封閉液，室溫封閉1 h后，加入anti-EGFR、anti-Akt抗體4℃孵育過夜，管家蛋白GAPDH為內參蛋白。第2天，TBST清洗PVDF膜3次后，加入HRP標記的抗兔抗體，室溫孵育1 h，TBST再次清洗3遍后，ECL發(fā)光液顯色，并以膠片曝光保存。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 煙堿對NEC存活率的影響 與對照組比較，細胞培養(yǎng)3 d煙堿濃度為40和80 μg/ml的細胞活性均明顯下降，細胞培養(yǎng)5 d煙堿濃度為10、20、40和80 μg/ml的細胞存活率均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與細胞培養(yǎng)3 d比較，細胞培養(yǎng)5 d煙堿濃度為40和80 μg/ml的細胞存活率均明顯下降（均P＜0.05），見圖1。

圖1 不同濃度煙堿對NEC存活率的影響

2.2 煙堿對NEC細胞因子表達的影響 隨著煙堿刺激時間及濃度上升，IL-3、IL-5、IL-8、eotaxin-2及GMCSF表達水平總體呈上升趨勢，但煙堿刺激5 d時煙堿濃度為80 μg/ml的NEC IL-3、eotaxin-2和GM-CSF表達水平均下降，見圖2。

圖2 煙堿對NEC細胞因子表達的影響（a：煙堿對NEC內IL-3表達的影響；b：煙堿對NEC內IL-5表達的影響；c：煙堿對NEC內IL-8表達的影響；d：煙堿對NEC內eotaxin-2表達的影響；e：煙堿對NEC內GM-CSF表達的影響）

2.3 煙堿對NEC EGFR和Akt蛋白表達水平的影響兩種濃度煙堿刺激的NEC隨著煙堿刺激時間的增加，Akt蛋白表達水平均呈明顯上升趨勢，其中煙堿刺激5 d時煙堿濃度為80 μg/ml的NEC較40 μg/ml的NEC升高更為明顯；而煙堿在較高濃度及較長刺激時間等條件下才能上調EGFR蛋白表達水平，見圖3。

圖3 煙堿對NEC EGFR和Akt蛋白表達水平的影響（a：煙堿影響ECFR、Akt表達的電泳圖；b：煙堿對Akt蛋白表達水平的影響；c：煙堿對EGFR蛋白表達水平的影響）

3 討論

CRS是一種高度異質性慢性疾病，已成為一個重要的社會健康問題[7]。ECRS的病理特征是鼻腔鼻竇黏膜內大量嗜酸粒細胞集聚，是臨床鼻科學最具挑戰(zhàn)性和難治性的疾病之一。研究發(fā)現(xiàn)組織內嗜酸粒細胞增多不僅是ECRS的標志，也是疾病復發(fā)的重要危險因素[8]。多種上皮細胞來源的炎癥細胞因子參與嗜酸性氣道炎癥的過程，2型細胞因子介導的炎癥反應可以刺激嗜酸粒細胞聚集，導致ECRS的發(fā)生、發(fā)展[9]。驅動先天性2型炎癥的上皮源性炎癥細胞因子已經被充分研究，如IL-5是一種眾所周知的2型細胞因子，對嗜酸粒細胞集聚和活化具有重要作用[10]。IL-3和GM-CSF在促進2型炎癥反應中也具有至關重要的作用[11]，持續(xù)IL-3刺激可誘導嗜酸粒細胞脫顆粒作用，是局部炎性反應中可激活嗜酸粒細胞的最強的效應分子[12]。IL-8對淋巴細胞和嗜堿細胞也具有趨化作用，可以加重局部的炎性反應，可以增加嗜酸粒細胞的跨基底膜遷移，促進鼻息肉發(fā)病過程[13]。

既往研究發(fā)現(xiàn)煙堿與嗜酸粒細胞性炎癥或變應反應性炎癥無相關性[14]，但筆者前期研究結果表明ECRS和煙堿之間存在正相關性[5-6]，說明煙堿在ECRS發(fā)病機制中是具有促進作用的，但潛在病理機制仍不明確。Van Hove等[15]研究發(fā)現(xiàn)煙堿可通過樹突狀細胞相關途徑加重變應性炎癥。同時，也有研究表明慢性吸煙暴露可加重氣道嗜酸粒細胞性炎癥，促進氣道黏膜重塑，其機制可能與IL-5、IL-1RA、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、缺氧誘導因子-1α表達上調有關[16]。

變應性鼻炎和CRS的鼻黏膜中EGFR表達量均顯著增加[17]，且激活EGFR/Akt信號通路可誘導氣道上皮細胞分泌黏液和炎性細胞因子GM-CSF、eotaxin和VEGF等，在氣道嗜酸粒細胞性炎癥中起重要作用[18]。為了確定煙堿刺激是否對NEC產生毒性反應，以了解煙堿對鼻竇黏膜中的作用，本研究選擇不同濃度的煙堿，在培養(yǎng)條件下模擬吸煙者吸煙時NEC接觸到的煙堿水平。結果表明，煙堿能夠隨著刺激時間和濃度的增加顯著上調細胞因子 IL-5、IL-3、IL-8、eotaxin-2、GM-CSF及Akt等的表達量，且NEC活性降低，但是IL-3、eotaxin-2和GM-CSF在第5天的表達水平下降，這或許是因為煙堿隨著刺激時間及濃度升高明顯降低了NEC活性所致。另發(fā)現(xiàn)煙堿在較高濃度及較長刺激時間等條件下才能顯著上調EGFR的表達，這說明煙堿在調控EGFR/Akt信號通路之外或許還有其他通路促進2型細胞因子的表達。

綜上所述，煙堿或許通過調控EGFR/Akt信號通路上調IL-3、IL-5、IL-8、eotaxin-2、GM-CSF等細胞因子的表達，致鼻黏膜內嗜酸粒細胞募集，促進嗜酸粒細胞性炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展。本研究結果初步闡明了煙堿在ECRS發(fā)病機制中的生物學作用，也可以解釋為什么吸煙者比非吸煙者的CRS術后復發(fā)率更高[19]。因此，戒煙應該是有助于降低ECRS的術后復發(fā)率。但是，NEC作為鼻黏膜免疫屏障層，是對吸入性污染物、刺激物和毒素的第一道防御。黏膜免疫屏障功能主要由連接上皮細胞的細胞間連接的完整性決定[20]，煙堿是否可破壞鼻黏膜免疫屏障功能，加重鼻黏膜嗜酸粒細胞性炎癥的機制需要進一步的研究。