施谷平 孫宇

食管癌是我國(guó)常見的一種消化道腫瘤，具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差等臨床特點(diǎn)[1]。近年來(lái)，雖然食管癌的綜合治療水平得到了明顯提升，但患者的生存率仍然較低[2]。研究證實(shí)食管癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段的復(fù)雜過程，多種癌基因和抑癌基因異常表達(dá)參與其中[3-4]。因此，深入研究食管癌的分子機(jī)制具有十分重要的作用。泛素結(jié)合酶E2B（Ubiquitin conjugating enzyme E2 B,UBE2B）是泛素化家族成員之一[5]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，UBE2B參與多種人類惡性腫瘤，如口腔鱗狀細(xì)胞癌、直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌等癌癥的發(fā)病過程[6-8]。然而，目前有關(guān)UBE2B在食管癌中的作用研究較少見。本研究主要探討UBE2B在食管癌中的表達(dá)情況及其臨床意義，并且初步研究UBE2B在食管癌中的生物學(xué)功能。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 包含34對(duì)食管癌組織及配對(duì)癌旁組織的食管癌組織芯片（EC-1402）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。人食管癌細(xì)胞株Eca-109購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。UBE2B抗體、上皮性鈣黏附蛋白（E-cadherin）抗體、神經(jīng)性鈣黏附蛋白（N-cadherin）抗體、Slug抗體、Snail抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人的IgG、支原體檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、硝酸纖維素膜均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、Transwell小室（8 μm孔）均購(gòu)自美國(guó)Corning公司；FBS購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Lipofectamine 3000、Matrigel膠、蛋白酶與磷酸酶抑制劑均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；BCA定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；UBE2B特異性敲低靶向siRNA及對(duì)照siRNA均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；倒置熒光相差顯微鏡（型號(hào)：CKX53）購(gòu)自日本Olympus公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（型號(hào)：ABI Step One Plus）購(gòu)自美國(guó)ABI公司；垂直電泳儀（Power Pac Basic）和蛋白轉(zhuǎn)印模塊（Mini Trans-Blot Cell）均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；低溫離心機(jī)（型號(hào)：Thermo Scientific MicroCL 21R）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：BIO-RAD Gel Doc XR+）購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 生物信息分析 從癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.cancer.gov）下載食管癌患者臨床信息及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA sequencing，RNA-Seq）數(shù)據(jù)，利用R語(yǔ)言進(jìn)行分析。比較食管癌組織與正常組織中UBE2B mRNA的表達(dá)差異。根據(jù)表達(dá)中值將食管癌樣本分為UBE2B高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較兩組患者生存差異。

1.3 UBE2B蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。組織芯片置于65℃烘箱中烤片后，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟、脫水，0.01 mol/L檸檬酸（pH=6.0）緩沖液高壓修復(fù)抗原8 min，3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶10 min，滴加UBE2B抗體（1∶200），4℃孵育過夜，PBS沖洗。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人的IgG，37℃孵育30 min，PBS沖洗。滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫色，返藍(lán)，脫水封固。結(jié)果判讀采用雙盲法：由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立雙盲閱片，結(jié)果取其平均值。每張組織切片在高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取至少5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)算＞200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色結(jié)果判定。每張切片進(jìn)行半定量記分，最終積分=細(xì)胞染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比。細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：＜5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%～100%為4分；最終積分0～3分為陰性，4～12分為陽(yáng)性。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人食管癌細(xì)胞株Eca-109培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)傳代培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體感染的檢測(cè)，從而保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)。將Eca-109細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染特異性靶向UBE2B的siRNA以敲減UBE2B的表達(dá)（si-UBE2B組）和非靶向?qū)φ誷iRNA（sicontrol組）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 3000說(shuō)明書進(jìn)行，具體如下：將Eca-109細(xì)胞接種到六孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先將培養(yǎng)基分別與si-UBE2B以及si-control混合，同時(shí)將培養(yǎng)基與Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫靜置5 min，隨后將si-UBE2B培養(yǎng)基混合液及si-control培養(yǎng)基混合液分別與Lipofectamine 3000培養(yǎng)基混合液相混合，混勻后室溫靜置5 min。將上述兩組混合液分別加入六孔板中，繼續(xù)放入37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集轉(zhuǎn)染后的兩種細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)小室膜無(wú)Matrigel膠覆蓋，而侵襲實(shí)驗(yàn)小室膜有Matrigel膠覆蓋。收集轉(zhuǎn)染成功的Eca-109細(xì)胞，并用無(wú)血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，將100 μl細(xì)胞懸液（含5×104個(gè)細(xì)胞）接種在Transwell小室的上室中，下室則放置含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。放置培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集染色細(xì)胞。Transwell小室先用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗后干燥，置于顯微鏡下觀察，選取4個(gè)低倍視野（×100）拍照并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

1.6 細(xì)胞UBE2B及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Slug和Snail）表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。將轉(zhuǎn)染成功的Eca-109細(xì)胞，移去培養(yǎng)基后，PBS清洗3遍。將培養(yǎng)皿放置冰上，加入適量RIPA細(xì)胞裂解液裂解，使用細(xì)胞刮收集蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。樣品蛋白經(jīng)100℃高溫變性后放入-80℃冰箱備用。將蛋白樣經(jīng)過10%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗UBE2B抗體（1∶1 000）、E-cadherin抗體（1∶1 000）、N-cadherin抗體（1∶1 000）、Slug抗體（1∶1 000）、Snail抗體（1∶1 000）。4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，通過ECL化學(xué)發(fā)光法，在成像系統(tǒng)中掃描并分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prim 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織和正常組織中UBE2B mRNA表達(dá)水平及總體生存率比較 生物信息分析結(jié)果顯示，與正常組織比較，食管癌組織中UBE2B mRNA表達(dá)水平較高（P＜0.01），見圖1a。生存分析結(jié)果顯示UBE2B高表達(dá)組患者總體生存率明顯低于UBE2B低表達(dá)組（P＜0.01），見圖1b。

圖1 食管癌組織和正常組織中UBE2B mRNA表達(dá)水平及總體生存率比較（a：食管癌組織和正常組織中UBE2B mRNA表達(dá)水平比較，*P＜0.01；b：食管癌組織中UBE2B高表達(dá)組和低表達(dá)組患者總體生存率比較）

2.2 食管癌組織和正常組織中UBE2B蛋白的表達(dá)比較 組織芯片免疫組化結(jié)果顯示，食管癌組織中UBE2B蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為76.47%（26/34），高于正常組織的29.41%（10/34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.1，P＜0.01），見圖2。

圖2 食管癌組織和正常組織中UBE2B蛋白的表達(dá)（免疫組化染色）

2.3 si-UBE2B組和si-control組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 與si-control組比較，si-UBE2B組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低（均P＜0.01），見圖3和表1。

圖3 si-UBE2B組和si-control組遷移和侵襲細(xì)胞的染色圖

表1 si-UBE2B組和si-control組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較（個(gè)）

2.4 si-UBE2B組和si-control組細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平比較 與si-control組比較，si-UBE2B組細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin明顯升高，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Slug和Snail均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表2和圖4。

表2 si-UBE2B組和si-control組細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平比較

圖4 si-UBE2B組和si-control組細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

食管癌在全球癌癥相關(guān)死亡原因中排名第6位，嚴(yán)重威脅人類健康[9]。我國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)，食管癌患者主要集中在河南、河北等中原地區(qū)。食管癌主要分為食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌2種主要病理類型，我國(guó)絕大部分食管癌為食管鱗狀細(xì)胞癌[1,10]。近年來(lái)，隨著早期診斷、根治性手術(shù)和術(shù)后輔助治療的快速發(fā)展，我國(guó)食管癌患者預(yù)后有了一定的改善，但總體5年總生存率僅為20%～40%[2]。食管癌患者預(yù)后差主要是由于早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。研究表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是促進(jìn)食管癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要通路[11-12]。因此，迫切的需要從分子水平研究食管癌的發(fā)生及其轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為食管癌的早期診斷及靶向治療提高新的方向。

UBE2B是泛素結(jié)合酶E2家族的成員，參與細(xì)胞的分化、周期和代謝等多種生物功能[13-15]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，UBE2B參與了腫瘤的發(fā)病過程。在結(jié)直腸癌中，UBE2B的異常高表達(dá)降低了腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，影響腸癌患者的預(yù)后[7]。在口腔癌中，miR-455-5p通過UBE2B參與腫瘤的發(fā)展過程[6]。UBE2B通過調(diào)節(jié)O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶泛素化水平影響鼻咽癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[16]。但在食管癌中尚未研究報(bào)道。本研究中，首先應(yīng)用生物信息分析技術(shù)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中食管癌RNA-Seq數(shù)據(jù)。分析結(jié)果顯示UBE2B mRNA在食管癌組織中異常高表達(dá)，并且與不良生存預(yù)后顯著相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述分析結(jié)果，本研究應(yīng)用食管癌組織芯片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證實(shí)了UBE2B在食管癌組織中異常高表達(dá)。免疫組化結(jié)果和TCGA生物信息分析結(jié)果相互佐證了UBE2B在食管癌中發(fā)揮了癌基因的作用，促進(jìn)食管癌的發(fā)生、發(fā)展。為了進(jìn)一步研究UBE2B的生物學(xué)功能，siRNA用于敲低食管癌細(xì)胞Eca-109細(xì)胞UBE2B的表達(dá)。生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)表明，敲低UBE2B能夠顯著抑制Eca-109細(xì)胞的遷移能力。進(jìn)一步深入研究，本研究發(fā)現(xiàn)敲低UBE2B能夠顯著增加上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達(dá)，降低間質(zhì)蛋白標(biāo)志物Slug、Snail和N-cadherin蛋白的表達(dá)。因此，UBE2B在食管癌中發(fā)生、發(fā)展中扮演了癌基因的重要角色。

綜上所述，UBE2B異常高表達(dá)是食管癌患者生存的獨(dú)立影響因素，有望成為判斷預(yù)后的分子靶標(biāo)。UBE2B主要通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進(jìn)食管癌的轉(zhuǎn)移，為食管癌的治療提高了新的思路。