孟若雪

（貴州省植物保護研究所，貴州 貴陽 550006）

植物在人的生存發(fā)展中起著尤為重要的作用。植物可作為食物、觀賞、災害防控等作用，植物的第二大病原是植物病毒，植物病毒每年給重要經(jīng)濟作物帶來嚴重的損失，全世界每年農(nóng)作物遭到植物病毒危害造成的損失達200 億美元［1］，對人類的生存和發(fā)展構(gòu)成嚴重威脅。植物病毒病有很多種，對植物的影響不僅包括外觀的損害，還包括植物的質(zhì)量，在植物病毒病的防控方面人們采取了很多措施，但并不能阻止植物病毒病的快速傳播，所以切斷來源就成了最為重要并且主要的防控措施，生產(chǎn)初期對植物種苗以及種薯進行脫毒處理便成為主要的防控措施。

植物病毒病的識別、診斷及病原鑒定比真菌和細菌病害的鑒定更復雜，傳統(tǒng)植物病毒病一般根據(jù)癥狀，發(fā)生特征、寄主類型、植物長勢、顯微鏡觀察以及血清學方法進行檢測鑒定，常依靠的是試驗人員的經(jīng)驗［2］。這些方法存在很多不足，因為很多病毒在引起病害過程中的病癥較相似，寄生在寄主的過程中變化也較快，不能根據(jù)簡單的血清學方法鑒定，因此，只依靠傳統(tǒng)的方法進行檢測，不但影響檢測效率，還很難適應多種變化的檢測環(huán)境。

隨著分子生物學、生物化學、免疫學的進步，為植物病毒的鑒定監(jiān)測和量化提供了新的方法。NOTOMI 等［3］于2000年開發(fā)了一種新型的核酸擴增方法——環(huán)介導等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplifica?tion，LAMP），該方法只需要一臺環(huán)介導等溫擴增儀，在等溫條件下可以高效、靈敏、快速、特異地擴增靶序列，且操作簡便，適合各種各樣的檢測環(huán)境。該方法廣泛應用于醫(yī)學病原物檢測、食品安全檢測、飲用水檢測等方面，近年來，開始應用于植物病原物的檢測，但在應用過程中呈現(xiàn)出一些問題。介紹LAMP方法的原理、特點、植物病毒LAMP檢測的應用進展以及未來的發(fā)展趨勢，為植物病毒病的早期預防提供技術(shù)支撐，同時也為該技術(shù)更好應用于其他領(lǐng)域提供借鑒。

1 LAMP方法原理及特點

1.1 LAMP引物的設(shè)計和擴增原理

在LAMP反應中，引物設(shè)計較復雜，決定LAMP 方法能否具有高效特異反應的關(guān)鍵主要在于引物設(shè)計的合理性，只有最佳的引物才能與Bst 聚合酶產(chǎn)生鏈置換反應。設(shè)計LAMP 引物的過程主要是針對靶基因的6 個特定區(qū)域，通過LAMP引物的設(shè)計原理，主要設(shè)計4個引物，包括1對外引物和1對內(nèi)引物。如果想提高引物的特異性并且縮短LAMP反應的時間，還可以在引物組里面添加1對環(huán)引物［4-5］，如圖1所示。

圖1 靶基因上6個區(qū)域和引物位置（摘自日本榮研株式會社）

Bst DNA 聚合酶適宜的溫度是60～65℃，所以LAMP 反應溫度一般設(shè)置為60～65℃，并且是等溫擴增，不同病毒LAMP 反應的溫度可能略有差異。LAMP 反應的第一階段如圖2所示，模板首先與內(nèi)部引物進行特異性結(jié)合，同時，在聚合酶作用下進行有效的擴增反應，特定的序列開始向前延伸，在引發(fā)鏈中進行置換反應，替換新的目的序列，然后引入外部引物以形成環(huán)結(jié)構(gòu)［6］。第二階段，主要涉及到內(nèi)部引物的參與，引物和模板進行特異性識別的過程中，模板通過延伸和置換無限的循環(huán)作用，在反應結(jié)束后，形成大小不同的雙鏈DNA混合物［7-8］。

圖2 LAMP反應原理（摘自日本榮研株式會社）

1.2 LAMP的反應體系

LAMP 反應體系需要在緩沖液、鎂離子、活性酶和引物組的參與下完成。LAMP 所需的酶是具有鏈置換功能的Bst DNA 聚合酶，并且RT-LAMP 還需要添加抑制酶和逆轉(zhuǎn)錄酶；緩沖液的主要作用是在LAMP 擴增過程中起輔助和緩沖在適當?shù)臈l件下進行反應；引物組包括外部引物和內(nèi)部引物，外部引物和內(nèi)部引物的濃度不同；與此同時，鎂離子和dNTP 的參與也非常重要，在這些試劑的共同作用下，酶才能進行充分反應。并且LAMP 反應中各個試劑的濃度也會影響到反應進程，所以對體系中濃度的優(yōu)化可以提高LAMP反應的效率［9］。

1.3 LAMP方法的特點

1.3.1 高效、快速、耗時短 整個擴增反應在恒定溫度（60～65℃）進行，過程中不需要經(jīng)過普通PCR那樣幾十次循環(huán)的變性退火延伸過程，體系反應時間大大縮短，通常在60 min 內(nèi)就可以完成反應并檢測指定樣品［10］。

1.3.2 特異性比較強 設(shè)計LAMP 引物的過程較繁瑣，LAMP 的4 條引物主要是針對靶基因的6 個區(qū)域進行設(shè)計，并且這6 個區(qū)域之間的序列識別有嚴格的順序性，這決定了LAMP方法具有較高的特異性。

1.3.3 操作便捷且對儀器設(shè)備要求不高 LAMP 反應全程在固定溫度（常在60～65℃）中完成，所以只有確保等溫環(huán)境即可，對儀器要求不高，特別是對于基層實驗室，常見的水浴鍋就能滿足要求。

1.3.4 靈敏度高 LAMP 反應的靈敏度非常高，并且能夠在短時間內(nèi)對樣品進行擴增，擴增的數(shù)量級可以達到107數(shù)量級，最低能夠檢測到10 pg/μL 的樣品，比普通PCR 靈敏100 倍，并且LAMP 反應的準確性和實時熒光PCR 相當，因此當檢測病毒量較少的樣品時，LAMP方法比較適合［11］。

1.3.5 能夠直接擴增RNA LAMP 方法可直接擴增RNA，并且可以向體系中加入適量的逆轉(zhuǎn)錄酶和抑制酶，以實現(xiàn)一步法RT-LAMP的擴增。

1.3.6 結(jié)果判定簡便 LAMP 反應會形成大量白色沉淀物，可以通過肉眼直接觀察，還可以利用實時濁度儀進行全程監(jiān)控，通過沉淀產(chǎn)生的時間和產(chǎn)生的量進行數(shù)據(jù)的量化，判斷擴增的效率及效果，提高條件優(yōu)化的效率，準確掌握方法的靈敏度，反應結(jié)束也不需要通過凝膠電泳進行觀察，可以省去這一繁瑣的過程，也避免試劑的污染［12］。

1.3.7 LAMP反應的缺點 LAMP反應至少需要涉及4條特異性引物，并且對序列的特異性要求特別高，如果設(shè)計不合理，可能會導致非目標擴增鏈的產(chǎn)生，嚴重影響到結(jié)果的判斷，與此同時，LAMP 實驗過程容易污染，則可能難以檢測并且不能檢測到靶基因的序列。另外，引物的長度也是LAMP 反應的一個關(guān)鍵點，所以在LAMP 引物設(shè)計過程中引物的長度最好在300 bp以內(nèi)［13］。

1.4 LAMP的產(chǎn)物檢測

1.4.1 直接法 在LAMP反應期間、擴增過程中會產(chǎn)生白色沉淀物焦磷酸鎂，如果該產(chǎn)物達到一定濃度，則可以直接通過肉眼進行觀察，因此通過肉眼觀察產(chǎn)物中有無沉淀的產(chǎn)生是最直接簡單明了的檢測方法［14］。

1.4.2 間接法

1）隨著科技的進步，研究人員研制出了可以對LAMP反應整個過程進行實時監(jiān)控的儀器——LAMP 濁度儀，可以對LAMP 反應過程中產(chǎn)生的白色沉淀進行實時分析，并且每一秒的濁度都是通過數(shù)據(jù)進行呈現(xiàn)，然后可以根據(jù)該數(shù)據(jù)繪制曲線，直觀地觀察到LAMP 反應的實時濁度，還可以分析反應速率，對比不同的樣品［15］。

2）熒光染料可以與LAMP 反應過程中產(chǎn)生的雙鏈DNA 結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號，因此，將SYBR Green I 等熒光染料添加到產(chǎn)物中后，產(chǎn)物的顏色會發(fā)生變化，如果產(chǎn)物為陽性，則產(chǎn)物的顏色會變成熒光綠色，如果沒有變色則說明該產(chǎn)物是陰性［16］。

3）通過瓊脂糖凝膠電泳也可以觀察到LAMP 擴增產(chǎn)物，電泳后，在瓊脂糖凝膠上可以看到清晰的梯形帶，便于觀察。通過凝膠電泳觀測，電泳圖如果產(chǎn)生了梯形條帶則證明產(chǎn)物是陽性，反之則是陰性［17-18］。

2 LAMP技術(shù)在植物病毒檢測中的應用

2.1 植物DNA病毒的檢測

植物DNA 病毒種類相對較少，目前應用LAMP 技術(shù)檢測植物DNA 病毒的研究也相對較少。其中較為典型的植物DNA 病毒有花椰菜花葉病毒，其具有重要經(jīng)濟價值和生物學意義，其在35S 啟動子區(qū)域含有3個轉(zhuǎn)錄因子專一的結(jié)合位點［19-20］。

FUKUTA 等［21］建立的基于CaMV35S啟動子的LAMP 檢測方法，可檢測出轉(zhuǎn)基因大豆及其產(chǎn)品中含量為0.5%～5%的轉(zhuǎn)基因成分。孫敏等［22］采用LAMP 方法檢測花椰菜花葉病毒CaMV35S 啟動子，靈敏度可達0.002%，遠高于歐盟標準，且LAMP 檢測法與實時熒光PCR 法的檢測結(jié)果完全相同。陳金松等［23］針對玉米表達載體的花椰菜花葉病毒35S啟動子（CaMV35S）的6個區(qū)域設(shè)計4 種特異引物，建立轉(zhuǎn)基因玉米花椰菜花葉病毒35S 啟動子環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測方法，為檢測轉(zhuǎn)基因玉米花椰菜花葉病毒35S啟動子提供了一種更加簡便快速的方法。肖維威等［24］針對CaMV35S 啟動子設(shè)計4 對特異性引物，建立的LAMP 法具有快速、簡單、可視化、靈敏度高和特異性強等優(yōu)點，可應用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的初步篩選。

2.2 植物RNA病毒的檢測

對于RNA 病毒的檢測，科研工作者采取在LAMP 體系內(nèi)加入RNA 酶抑制劑和RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶，從而建立了逆轉(zhuǎn)錄LAMP（reverse transcription LAMP，RT-LAMP）技術(shù)，RT-LAMP 技術(shù)可省去反轉(zhuǎn)錄的步驟和減少在擴增核酸過程的污染幾率，該方法在速度上快于RT-PCR 檢測方法，靈敏度也是RT-PCR的10～100倍。

RT-LAMP 技 術(shù) 由NOTOMI 等［3］建立，但首先應用該技術(shù)檢測RNA 病毒的則是FUKUTA 等人，應用該技術(shù)快速檢測出了葉片、種子、根、莖中的日本紅薯花葉病毒（JYMV）［25］。NIE［26］分別利用RT-LAMP技術(shù)檢測了240 份樣品中的植物Y 病毒屬（Potato Virus Y），檢出率均為97.5%。國內(nèi)劉雅馨等［27］用RT-LAMP 方法對疑似感染櫻桃小果病的樣品進行檢測，在35 個樣品中檢測出13 個樣品感染了LChv-1，檢測結(jié)果與RT-PCR 法一致。RT-LAMP 法具有特異性強、操作簡單、快速等特點，適合對LChV-1樣品的快速檢測與鑒定。

袁英哲等［28］用RT-LAMP 方法在新疆甜瓜種子中檢測出黃瓜花葉病毒（CMV）和小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV），與常規(guī)的PCR 技術(shù)相比，靈敏度比常規(guī)RT-PCR 高10～100 倍，提高了檢測的效率。LE 等［29］2 h內(nèi)完成了RNA 快速提取到RT-LAMP 檢測，檢測出水稻條紋病毒（RSV），水稻東格魯桿狀病毒（RTBV），靈敏度比RT-PCR 高10倍。FUKUTA 等［30］建立了感染番茄的菊花斑點枯萎病毒RT-LAMP 檢測體系，靈敏度是RT-PCR 的100 倍，整個擴增過程不到1 h，在擴增過程中，加入了環(huán)引物，濁度20 min 就開始增加，大大提高了反應的可視度。聞偉剛等［31］在菜豆莢斑駁病毒（BPMV）RT-LAMP 體系中加入了2 條環(huán)引物，靈敏度是RT-PCR 的1 000 倍，從核酸的提取到結(jié)果觀察只需要2～2.5 h，該研究說明環(huán)引物可以大幅提高反應速度和效率。

除上述病毒外，吳凡等［32］建立了桑脈帶相關(guān)病毒的RT-LAMP 檢測體系；鄒佳伶等［33］建立了獼猴桃褪綠環(huán)斑病毒RT-LAMP 檢測體系；KUAN 等［34］建立了南瓜曲葉病毒（SLCV）LAMP 快速檢測體系；康明蛟等［35-36］建立了植物卷葉病毒RT- LAMP和豇豆重花葉病毒（CPSMV）的RT-LAMP 檢測體系；高彥萍等［37］對植物卷葉病毒（PLRV）RT-LAMP 的方法進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的RT-LAMP 檢測結(jié)果與RT-PCR一致。

2.3 植物類病毒的檢測

類病毒是目前為止發(fā)現(xiàn)的侵染植物的最小病原物，類病毒不編碼任何蛋白，完全依靠寄主植物進行復制，在復制過程中引起病癥，并且癥狀與病毒引起的病癥極為相似，很難區(qū)分，侵染過程不顯性，造成檢測鑒定較為困難［2］。由于類病毒不產(chǎn)生蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)的血清學方法不能滿足檢測需求，而LAMP方法的出現(xiàn)為類病毒的檢測提供了新的思路，該方法可以滿足類病毒檢測的特殊性，實現(xiàn)類病毒的高特異性和靈敏檢測。比較有代表性的類病毒是植物紡錘塊莖類病毒（PSTVd），大多數(shù)植物感染該病毒都不顯癥狀，并且潛育期很長，前期無法判斷是否感染了該病毒，較難檢測。TSUTSUMI等［38］利用RT-LAMP方法在番茄的葉片、塊莖、種子內(nèi)檢測出PSTVd，靈敏度是RT-PCR的10倍，所需的時間是RT-PCR的一半。另外，果樹類病毒檢測中LAMP技術(shù)也有應用，桃潛隱花葉類病毒（PLMVd）是危害桃的病原之一，不僅影響水果的品質(zhì)和口感，還影響果樹的長勢，引起倒伏等癥狀，對次年桃樹的生長發(fā)育產(chǎn)生嚴重影響，因此，希臘學者BOUBOURAKAS等［39］建立了PLMVd的RT-LAMP檢測體系，32 min即可在桃樣品中檢測出該類病毒，與RT-PCR的180 min相比，具有高效、快速特點，此外，該體系還能夠在其他果樹樣品中檢測到該類病毒。國內(nèi)辛言言等［40］建立了蘋果銹果類?。ˋSSVd）的RT-LAMP 檢測方法，具有靈敏度高、特異性強和檢測時間短的特點，可用于現(xiàn)場ASSVd的快速檢測。

3 展望

RT-LAMP 檢測技術(shù)有假陽性的缺陷，所以在體系建立過程中最好采用濁度儀實時檢測濁度，避免產(chǎn)物檢測的污染，同時通過設(shè)置空白對照的方式以確定沒有產(chǎn)生假陽性，并且通過重復性試驗結(jié)果可以判斷，RT-LAMP 不但具有重復性的特征，在重復的過程中不產(chǎn)生假陽性。在實際操作過程中，必須在超凈工作臺中進行RT-LAMP 體系的建立，RT-LAMP的產(chǎn)物必須及時丟棄，保證樣品不被污染［41］。

在LAMP 檢測過程中，可以與免疫磁珠捕獲結(jié)合進行分子檢測，該方法可以大大縮短時間，實現(xiàn)互補優(yōu)勢，更易于操作且經(jīng)濟；并且可以通過在引物對里添加環(huán)引物的方式提高RT-LAMP的反應速率［42］。

LAMP 技術(shù)雖因建立時間較短，還存在諸多問題，但其在大多數(shù)植物病毒檢測方面表現(xiàn)出特異性強、靈敏性高、產(chǎn)物檢測方便等優(yōu)點，使其在植物病毒快速檢測研究中應用價值越來越明顯，目前，該技術(shù)在植物病原、醫(yī)學病原、食品檢測等方面均有應用且效果良好。相信隨著該技術(shù)的不斷完善，該方法作為分子生物的一種快速檢測技術(shù)必將為及時控制重大植物病害的發(fā)生和流行、災變預警、分子病理學研究等提供技術(shù)支撐。