張欽語,韋春某,張邦喜,楊仁德,陳 旭,陳 波,王曉敏,朱森林

(1.貴州省農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，貴州 貴陽 550006；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心貴州分中心，貴州 貴陽 550006；3.貴州省菌草綜合開發(fā)利用技術(shù)工程中心，貴州 貴陽 550006)

靈芝是一種典型藥用菌，中國自古以來就將其當(dāng)作珍貴的中藥材加以利用，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中將其列為上品［1］。靈芝性溫、味苦，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，其含有多糖肽、三萜、靈芝酸、甾醇等有效成分［2-3］，具有提高人體免疫力、護肝、抗血栓、降血脂、治療神經(jīng)衰弱等多種功效［4-5］。2017年以來我國年產(chǎn)靈芝近20萬t，年產(chǎn)靈芝孢子粉2萬t［6］。近年來，靈芝主要以木屑袋料栽培，導(dǎo)致“菌林矛盾”問題日益突出，砍伐樹木，造成環(huán)境破壞。以菌草代替木屑栽培靈芝，能很好地解決“菌林矛盾”問題，菌草代料栽培的優(yōu)勢在于菌草機制成本低、來源廣泛、生物量積累大，栽培料（菌草）來源便利和保護環(huán)境等優(yōu)點［7-8］。菌草不僅能夠充分滿足靈芝栽培的營養(yǎng)條件，而且與木屑栽培沒有明顯的產(chǎn)量差異，同時還能夠獲得高品質(zhì)的靈芝子實體。通過對純木屑栽培料的改良，使用部分菌草替代木屑栽培料，能夠有效緩解“菌林矛盾”。因此，設(shè)計不同的菌草替代木屑梯度進(jìn)行靈芝栽培，通過對不同配方的靈芝菌絲和子實體觀察，結(jié)合靈芝子實體活性成分如多糖、三萜類物質(zhì)的分析，合理選擇栽培靈芝適宜的菌草替代量，以期為菌草替代木屑種植靈芝提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 黔芝2 號，是靈芝品種中抗逆性強，多糖、三萜和甾醇類物質(zhì)含量較高的品種之一，利于進(jìn)行栽培基質(zhì)優(yōu)化試驗。由貴州省農(nóng)作物品種資源研究所提供。

1.1.2 試驗試劑 PDA 培養(yǎng)基，購自索萊寶；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醇、碳酸氫鈉、鹽酸、乙酸乙酯、齊墩果酸均為分析純，購自貴州愛瑞特生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 電子分析天平，渡揚精密儀器（上海）有限公司；滅菌鍋，上海深諳醫(yī)療器械廠；水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；離心機，貝克曼庫爾特公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器有限公司；pH 計和紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 設(shè)置7 個菌草替代木屑用量梯度，栽培配方其他輔料不變，混合配制組成不同比例的栽培基質(zhì)配方。以完全木屑栽培基質(zhì)為CK，具體配方見表1。

表1 菌草代料栽培配方 %

1.2.2 栽培準(zhǔn)備 選擇在PDA 平板上菌絲生長健壯的黔芝2 號菌株，挑取0.5 cm 長的菌塊接入500 mL 的PDA 液體培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)24 h 后在25℃下振蕩培養(yǎng)（120 r/min）7 d。不同配方處理分別進(jìn)行栽培袋的拌料、裝袋、滅菌等工序，使用規(guī)格為18 cm ×38 cm × 0.05 cm 的聚丙烯塑料袋，每袋裝濕料1 100 g。每個配方設(shè)置20 個栽培袋，共計使用160個栽培袋。裝袋完成后在121℃下滅菌2 h。待栽培袋冷卻至30℃以下，在超凈工作臺中用液體母種接種栽培袋，每袋50 mL。菌絲發(fā)菌室溫保持在22～30℃，空氣濕度在60%左右，定時通風(fēng)，避光培養(yǎng)。在菌絲長滿袋后，菌袋表面菌絲體從白色轉(zhuǎn)為淺黃色或褐色膜，及時開出芝孔，保持培養(yǎng)室濕度在80%～90%，溫度控制在20～30℃，適度見光，定期通風(fēng)透氣。

1.2.3 不同代料栽培基質(zhì)配方下靈芝子實體比較 發(fā)菌完成后，在2～3 個月內(nèi)靈芝子實體完全成熟。不同的菌草栽培基質(zhì)配方的出菇情況不同，子實體的產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀也不同。在8 種不同配方中，每個配方10 袋栽培袋中隨機選取5袋記錄滿袋時間（即菌絲長滿栽培基質(zhì)的所需要的時間）、芝蕾形成時間、菌蓋長度、菌蓋寬度。同時分別計算不同配方的出芝產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率。

1.3 指標(biāo)測定

將每個配方收集到的靈芝子實體分別粉碎為靈芝子實體粉末，精密稱取1.00 g，參照NY/T 1676—2008 食用菌中粗多糖含量的測定標(biāo)準(zhǔn)，采用硫酸苯酚法，以葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線測定靈芝子實體多糖含量。

將每個配方收集到的靈芝子實體分別粉碎為靈芝子實體粉末，取100 g 靈芝子實體粉末加入500 mL 乙醇溶液進(jìn)行回流提取，合并提取液后，減壓濃縮至原體積的1/5，用碳酸氫鈉飽和溶液萃取2 次，在0℃條件下用6 mol/L 鹽酸酸化至pH 3～4，見有沉淀析出后，用乙酸乙酯再提取沉淀，提取液減壓濃縮后用乙醇溶解備用。參照王杉等［9］的靈芝三萜類物質(zhì)的測定方法對所采收的靈芝子實體中三萜類物質(zhì)的含量進(jìn)行測定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)使用Origin 2018 進(jìn)行繪圖，SPSS 16.0 中Duncan 法進(jìn)行方差（P<0.05）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配方的靈芝農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量

由表2可知，所有配方的栽培基質(zhì)都能夠順利出芝，不同配方的子實體具有顯著差異，隨著菌草替代木屑量的增加，靈芝菌絲的滿袋時間沒有明顯變化，均為63～65 d。在滿袋后對菌絲進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)菌草替代量增加，CK 的菌絲生長密度最為濃密，隨著菌草添加量增加，菌絲的生長密度逐漸稀疏，但各配方形成芝蕾的時間并無明顯差異，為70～72 d。表明菌草的添加量不影響芝蕾的形成時間。配方3 的子實體菌蓋長度最長，為10.57 cm；寬度最寬，為10.38 cm；較CK 分別高1.14%、1.35%。不同配方的生物轉(zhuǎn)化率為8.48%～13.65%，其中，配方3 為13.65%，CK 為12.84%，較配方3 低0.81%，且當(dāng)菌草的添加量大于30%后，靈芝的生物轉(zhuǎn)化率越小，對靈芝出芝的影響越大。配方3的袋均產(chǎn)量最高，為52.08 g，比CK 高1.8%；配方1和配方2 的袋均產(chǎn)量分別為49.35 g 和49.81 g，較CK 分別下降3.54%和3.64%；當(dāng)菌草的添加量超過配方3后，袋均產(chǎn)量逐漸下降；當(dāng)添加量達(dá)70%時（配方7），袋均產(chǎn)量僅有37.58 g，與30% 添加量相比下降了27.8%，表明當(dāng)菌草的添加量超過30%后，將對靈芝產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。結(jié)果與王凱等［10］研究結(jié)果一致。

表2 不同栽培基質(zhì)的靈芝子實體部分農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量

2.2 不同配方的靈芝多糖含量

由圖1可知，配方3 的多糖含量顯著高于其他配方，在配方3 的栽培基質(zhì)下，靈芝的多糖含量達(dá)9.26 mg/g，比CK 的多糖含量（5.64 mg/g）高64.18%；配方4 略低，為7.78 mg/g，比CK 高37.94%。但巨菌草的添加量在除配方3 和配方4 外與CK 的多糖含量差異不大。表明當(dāng)巨菌草替代30%～40%的木屑用量時，可顯著增加靈芝的子實體的多糖含量，提升靈芝品質(zhì)，獲得更高的活性多糖物質(zhì)。

圖1 不同栽培配方靈芝子實體的多糖含量

2.3 不同配方的靈芝三萜類物質(zhì)含量

由圖2可知，在CK 的栽培基質(zhì)下靈芝子實體得到的三萜類物質(zhì)含量僅為1.24 mg/g；配方3 的含量最高，為2.26 mg/g，比CK 高82.3%；配方1、配方2 和配方4 都分別比CK高22.6%、50%和30.6%，表明當(dāng)巨菌草替代木屑用量10%～40%時，有助于靈芝子實體三萜類物質(zhì)的產(chǎn)生，相比于CK 的純木屑栽培，菌草適當(dāng)替代木屑能夠使栽培的靈芝子實體在生長過程中積累更多的三萜類物質(zhì)。

圖2 不同栽培配方靈芝子實體的三萜含量

3 結(jié)論

研究表明，配方3（巨菌草30%、木屑48%、麩皮20%、石膏1%、蔗糖1%）最適宜栽培黔芝2 號，與CK 配方（巨菌草0%、木屑78%、麩皮20%、石膏1%、蔗糖1%）相比，菌絲生長相對稀疏，滿袋時間和芝蕾形成時間無差異。配方3 的子實體菌蓋長度最長，為10.57 cm；寬度最寬，為10.38 cm；比CK 配方分別高1.14%、1.35%。相比于其他配方，配方3 所獲的袋均產(chǎn)量最高，為52.08 g，比CK 配方高1.8%，其余配方的袋均產(chǎn)量均低于CK 配方。且配方3 栽培獲的靈芝子實體活性物質(zhì)多糖和三萜含量分別達(dá)9.26 mg/g、2.26 mg/g，比CK 配方分別高64.18%、82.3%，配方4 的多糖含量僅次于配方3，為8.01 g/mg。因此，配方3（巨菌草30%、木屑48%、麩皮20%、石膏1%、蔗糖1%）適合用于黔芝2號的菌草代料栽培。