王 敏，韓守安，張 雯，謝 輝，艾爾買克·才卡斯木，張付春，鐘海霞，弓佳琪，潘明啟

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學(xué)觀測試驗(yàn)站，烏魯木齊 830091；2 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】2018年新疆葡萄種植面積15.02×104hm2(225.3萬畝)。新疆日照時間長，晝夜溫差大，產(chǎn)生有機(jī)物質(zhì)多，葡萄品質(zhì)獨(dú)特口感佳，但也容易發(fā)生裂果。葡萄品種間存在明顯地裂果敏感性差異，部分歐亞種葡萄品種成熟期果皮極易開裂，歐美種葡萄品種極抗裂，木納格、無核白、無核紫、里扎瑪特等成熟期遇到降雨會造成裂果、落粒嚴(yán)重[1-2]。裂果是果實(shí)內(nèi)部壓力增大超出果皮承受范圍，植物自身應(yīng)對生理失調(diào)所作出反應(yīng)的一種生理性病害。裂果發(fā)生后會果汁外溢，微生物侵染，導(dǎo)致果實(shí)大面積腐爛，降低了果實(shí)商品價值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對荔枝[3]、西瓜[4]、棗[5]、番茄[6]等易裂果品種研究發(fā)現(xiàn)，裂果發(fā)生時細(xì)胞壁組分中果膠和纖維素等在水解酶的作用下水解，使果皮力學(xué)強(qiáng)度減弱并導(dǎo)致裂果。對杏[7]、棗[8]的研究發(fā)現(xiàn)，成熟期果皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞質(zhì)膜相對透性增大，果皮外部自由水分大量進(jìn)入果肉中，引起果肉細(xì)胞膨脹而裂果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同品種之間裂果差異性很大。需對比分析葡萄品種紅地球、新郁、里扎瑪特、無核紫、木納格5個不同裂性差異。【擬解決的關(guān)鍵問題】以紅地球、里扎瑪特、新郁、無核紫、木納格5個葡萄品種為材料，測定原果膠(Protopectin，SP)、水溶性果膠(Water-soluble pectins，WSP)、半纖維素(Hemicellulose)細(xì)胞壁組分含量及多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)、果膠甲酯酶(rapidasepep rapidase，PEP)、果膠裂解酶(Pectate lyases，PL)、纖維素酶(Cellulase，CE)細(xì)胞壁水解酶等組分，分析果皮解剖結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡情況，研究不同品種從轉(zhuǎn)色期至成熟期裂果特性的調(diào)控因子，為易裂果葡萄品種在新疆高效栽培提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料取自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗(yàn)場。2018年8月上旬～9月下旬(果實(shí)轉(zhuǎn)色期至成熟期)，每10 d采集1次樣品，共計采樣3次，分別記錄為花后70 d、花后80 d、花后90 d，以樹勢生長一致的新郁、紅地球、里扎瑪特、無核紫、木納格為材料，供試樹于2012年定植，株行距1 m×3 m，南北行向，正常管理。

采收無病害長勢均勻完整葡萄果實(shí)果穗，放入冰盒內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。在果穗上中下隨機(jī)取樣分份，液氮冷凍后置于-40℃冰箱內(nèi)保存。從葡萄果實(shí)中部切去取1 cm3小塊，固定于FAA固定液(50%酒精)用于石蠟切片及細(xì)胞凋亡檢測。

1.2 方 法

參考王旭旭等[9]方法，5個品種于3個采樣日期分別采集150粒果粒，隨機(jī)分為3組裝入紗網(wǎng)袋內(nèi)(每個沙網(wǎng)袋50粒)，浸泡于清水中，浸泡24 h后統(tǒng)計裂果率。

裂果率=(裂果粒數(shù)/總粒數(shù))×100%。

果膠、原果膠、纖維素、半纖維素，PG、PEP、CE、PL等果膠、纖維素降解關(guān)鍵酶酶活性測定，使用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒反應(yīng)后酶標(biāo)儀測定吸光度。

果皮解剖結(jié)構(gòu)觀察及細(xì)胞凋亡測定Tunel一步法(碧云天生物技術(shù)有限公司)，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下觀察、成像，使用imageJ軟件測量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0和Excel2013軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理統(tǒng)計分析及作圖，采用Duncan新復(fù)極差法(SSR)進(jìn)行結(jié)果差異顯著性檢驗(yàn)，顯著水平為P< 0.01，分析相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個葡萄品種不同時期裂果率差異

研究表明，5個品種之間浸水裂果率在轉(zhuǎn)色期至成熟期差異明顯，紅地球?yàn)椴涣压贩N，3個時期浸果24 h均未出現(xiàn)裂果；里扎瑪特為最易裂果品種，3個時期浸果裂果率均為幾個品種最高值，采收期裂果率達(dá)到99.33%；無核紫、木納格、新郁3個品種浸果24 h花后70 d裂果率分別為43.33%、38.67%、44.00%，花后80 d裂果率分別56.67%、52.67%、52.00%，花后90 d采收期裂果率分別為63.33%、62.00%、64.67%，差異未達(dá)到顯著水平，與品種之間特性相符，紅地球?yàn)樽畈灰琢哑贩N，里扎瑪特為極易裂品種，無核紫、新郁、木納格均為易裂品種。表1

表1 不同葡萄品種清水浸果裂果率

2.2 5個葡萄品種不同時期果膠、原果膠、半纖維素變化差異

研究表明，隨著果實(shí)逐漸成熟，原果膠含量整體曾遞增趨勢；里扎瑪特隨著時間推遲增幅不明顯；新郁、紅地球、里扎瑪特、木納格、無核紫花后80～90 d原果膠含量增幅分別為4.7%、31.6%、1.1%、-14.6%和15.6%，紅地球增幅最高且采收時含量最高；新郁、木納格花后70 d至花后80 d含量增加顯著，木納格花后80 d至花后90 d含量降低；無核紫3個時期增幅不顯著。隨著果實(shí)逐漸成熟，水溶性果膠含量曾遞增趨勢；新郁、紅地球、里扎瑪特、木納格、無核紫花后70～90 d水溶性果膠含量增幅分別為80.8%、26.1%、67.2%、47.9%、79.6%，紅地球增幅最低且花后90 d含量顯著低于除無核紫外的3個品種，新郁、里扎瑪特、木納格含量分別是紅地球的1.41、1.34、1.37倍；無核紫在花后80 d果膠含量高于花后90 d，各個時期果膠含量整體低于其他幾個品種。水溶性果膠/原果膠比值，紅地球呈現(xiàn)降低趨勢；里扎瑪特從花后80 d至花后90 d增幅達(dá)到64%，顯著高于其他品種；木納格呈現(xiàn)先增后降趨勢。新郁、紅地球、里扎瑪特、木納格、無核紫花后70～90 d半纖維素含量增幅分別為0.8%、-5.9%、134.7%、38.1%、79.3%，隨著采樣日期的推移里扎瑪特半纖維素含量顯著升高，紅地球半纖維素含量先增加后降低，隨著果實(shí)成熟則變化不顯著；里扎瑪特半纖維素含量與紅地球相比花后70、80、90 d，分別為0.79、0.54、1.35倍。圖1

圖1 不同葡萄品種不同時期細(xì)胞壁代謝物質(zhì)變化

2.3 5個葡萄品種不同時期PG、PEP、CE、PL酶活性變化差異

研究表明，PG(多聚半乳糖醛酸酶)酶活性隨著果實(shí)的成熟酶活性逐漸升高；紅地球酶活性在3個時期均為5個品種最低值；里扎瑪特與無核紫在花后90 d酶活性顯著高于與其他品種。PEP(果膠甲酯酶)酶活性隨著果實(shí)的成熟酶活性逐漸升高，每個時期各品種之間含量無明顯差異。PL(果膠裂解酶)酶活性隨著果實(shí)發(fā)育整體呈現(xiàn)上升趨勢；花后70 d、花后80 d活性變化不大，到花后90 d采收期時達(dá)到最大值，酶活性差距變大，5個品種中只有紅地球在采收期酶活性下降，里扎瑪特在采收期酶活性為5個品種中最高。5個品種纖維素酶活性整體都是曾增高趨勢，花后90 d達(dá)到最高值，只有不易裂品種紅地球CE(纖維素酶)酶活性花后80 d達(dá)到最高值，到花后90 d酶活性下降，是5個品種中唯一有下降趨勢的品種。圖2

圖2 不同品種不同時期細(xì)胞壁代謝酶活性變化

2.4 采收期細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化差異及細(xì)胞凋亡程度

研究表明，5個品種之間凋亡程度與裂果率存在正相關(guān)關(guān)系。里扎瑪特最易裂果，細(xì)胞凋亡情況最明顯，角質(zhì)膜層凋亡重，染色深；亞細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)染色變深黃甚至偏黑，細(xì)胞與細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)也被染色明顯，細(xì)胞凋亡度最高，細(xì)胞損傷度最高。無核紫采收時期相較其他品種更晚，采收時有成熟過度情況，凋亡程度很嚴(yán)重，從角質(zhì)層到亞表皮細(xì)胞都被染色較深，但是角質(zhì)層染色區(qū)域少，凋亡明顯。木納格易裂果，細(xì)胞質(zhì)被染成黃色，凋亡也比較明顯。新郁從細(xì)胞質(zhì)到表皮細(xì)胞亞表皮細(xì)胞均有被染色，但面積不大，凋亡程度比其他品種淺，亞表皮細(xì)胞之間由于胞間質(zhì)降解出現(xiàn)空腔。紅地球作為最抗裂品種，整體染色呈現(xiàn)為藍(lán)色，凋亡度最弱，細(xì)胞結(jié)構(gòu)整齊無損傷。圖3

注：→空腔 角質(zhì)膜層明顯凋亡

研究表明，裂果與果皮解剖結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。里扎瑪特角質(zhì)層達(dá)到4.12 μm，顯著厚于其它品種，但角質(zhì)層極不平整，有斷裂和缺口處；表皮細(xì)胞截面積422.44 μm2，顯著高于除新郁外的品種；亞表皮細(xì)胞截面積為1 905.43 μm2，僅高于無核紫，但細(xì)胞不規(guī)則，排列松散，細(xì)胞間隙明顯。紅地球角質(zhì)層平整且光滑，亞表皮細(xì)胞排列規(guī)則且緊密，細(xì)胞間無明顯間隙。新郁表皮細(xì)胞526.16 μm2及亞表皮細(xì)胞橫截面積3 235.23 μm2顯著高于其他品種，角質(zhì)層較不平整，有少量的缺口，細(xì)胞不規(guī)則，排列松散，細(xì)胞間間隙明顯。木納格、無核紫角質(zhì)層不平整，有少量缺口，木納格亞表皮細(xì)胞排列比較規(guī)則，排列緊密；無核紫亞表皮細(xì)胞排列不規(guī)則，排列比較松散，表皮細(xì)胞橫截面積219.55 μm2、亞表皮細(xì)胞橫截面積608.76 μm2顯著低于其他品種。表2

表2 成熟期不同品種果實(shí)表皮結(jié)構(gòu)及差異性

3 討 論

植物細(xì)胞壁是由眾多不同分子組成復(fù)雜而動態(tài)結(jié)構(gòu)，將單個細(xì)胞圍住有助于保持細(xì)胞形狀的機(jī)械強(qiáng)度，為細(xì)胞擴(kuò)張?zhí)峁┝丝臻g[10]。細(xì)胞壁的基本框架主要由纖維素微纖維和半纖維素多糖(如木聚糖)組成，并嵌入果膠的復(fù)雜基質(zhì)中；細(xì)胞壁代謝相關(guān)的水解酶主要包括纖維素酶、果膠甲脂酶、果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶等，果膠裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶主要的生理作用是分解果膠類物質(zhì)，并破壞與果膠類物質(zhì)形成的果膠酸鈣，減弱細(xì)胞間相互作用力[11，12]。纖維素是細(xì)胞壁主要成分之一，纖維素酶主要作用是降解纖維素，降低細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度。王保明等[8]發(fā)現(xiàn)在易裂棗果實(shí)生長過程中原果膠、纖維素含量降低，水溶性果膠含量增加；裴健翔[13]研究發(fā)現(xiàn)，噴鈣處理降低了蘋果果實(shí)代謝酶活性，抑制了原果膠及纖維素降解、可溶性果膠上升；李建國[14]研究發(fā)現(xiàn)，易裂荔枝果皮中果膠酶、纖維素酶、果膠甲酯酶等水解酶活性比不易裂品種高，且果膠酶差異最明顯；張川[6]等研究發(fā)現(xiàn)，隨著番茄果實(shí)的成熟細(xì)胞壁降解酶大量合成，導(dǎo)致易裂果品種中代謝酶類組成可溶性蛋白含量高于耐裂果品種；郭紅彥[15]不同時期葉面噴施鈣能夠降低裂果率，降低代謝酶活的含量，提升了原果膠與纖維素的含量。

研究發(fā)現(xiàn)，葡萄果實(shí)從轉(zhuǎn)色期至成熟期采收前，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)、細(xì)胞水解酶曾遞增趨勢；紅地球的原果膠含量采收期含量高于其他易裂品種且花后80至90 d增幅顯著高于其他易裂品種，在取樣的3個時期紅地球水溶性果膠的含量低于其他易裂品種且花后70～90 d增幅顯著低于其他品種，原果膠與水溶性果膠的比值持續(xù)降低，在采收期果膠裂解酶酶活性下降，果膠酶叫其他易裂品種3個時期均含量偏低；在果實(shí)成熟期易裂品種在細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶果膠酶和果膠裂解酶的作用下降解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)多糖，果膠轉(zhuǎn)化為水溶性果膠，降低了果皮的強(qiáng)度及細(xì)胞壁的延伸性進(jìn)而誘導(dǎo)了裂果的發(fā)生。耐裂品種紅地球半纖維素含量先增加后降低，果實(shí)成熟變化不顯著，但是采收期纖維素酶含量不增反減，果皮強(qiáng)度保持不明顯降低，裂果不易發(fā)生；但易裂品種里扎瑪特的半纖維素含量在成熟期確顯著升高，原因是纖維素轉(zhuǎn)化為半纖維素后果皮強(qiáng)度下降，導(dǎo)致裂果的發(fā)生。纖維素酶將纖維素分解轉(zhuǎn)化為半纖維素，細(xì)胞壁代謝相關(guān)物質(zhì)半纖維素含量及其相互交聯(lián)是果皮強(qiáng)度的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，與果實(shí)裂果發(fā)生密切相關(guān)。此研究結(jié)果與前人結(jié)果研究一致[13-16]。研究中酶活性未達(dá)到顯著性水平。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序死亡主動過程[17]。果皮細(xì)胞隨著果實(shí)的成熟期會發(fā)生明顯凋亡現(xiàn)象，致使果皮結(jié)構(gòu)破壞，果皮強(qiáng)度降低，導(dǎo)致裂果，研究中能明顯看到4個易裂品種在采收期均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，極易裂品種里扎瑪特凋亡程度最重，細(xì)胞老化衰亡嚴(yán)重，細(xì)胞完整度不好，易裂品種無核紫、新郁、木納格也出現(xiàn)不同程度凋亡，紅地球基本沒有表現(xiàn)出凋亡現(xiàn)象。

果實(shí)表皮細(xì)胞大小及排列度、角質(zhì)層表皮細(xì)胞厚度等對決定的抗裂能力具有重要作用，角質(zhì)層是有效的水分屏障，出現(xiàn)明顯的斷裂和缺口時，致使水分滲透，導(dǎo)致裂果發(fā)生[18]。龐洪翔[19]等發(fā)現(xiàn)易裂葡萄品種木納格角質(zhì)層、表皮與亞表皮較厚，表皮細(xì)胞排列松散不規(guī)則，不易裂品種巨峰、玫瑰香細(xì)胞排列較規(guī)則、緊密。劉世鵬等[20]發(fā)現(xiàn)，裂果指數(shù)與其角質(zhì)層細(xì)胞密度、表皮厚度、環(huán)腕部表皮最厚處、最薄處細(xì)胞厚度具負(fù)顯著相關(guān)性。王保明[8]等發(fā)現(xiàn)在成熟期棗果肉細(xì)胞增大且排列松散、大小不規(guī)則，具有明顯的空腔現(xiàn)象。研究顯示，易裂品種角質(zhì)層不平整有斷口與缺鏈，表皮細(xì)胞排列松散，亞表皮細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞間有間隙，與前人研究結(jié)論一致[21-23]。

4 結(jié) 論

隨著葡萄果實(shí)的成熟，原果膠含量最高且采收前10 d至采收期原果膠含量增速達(dá)到31.6%顯著高于易裂品種里扎瑪特的1.1%，易裂品種新郁、里扎瑪特水溶性果膠含量增速達(dá)到80.8%、67.2%顯著高于不易裂品種26.1%，易裂品種里扎瑪特半纖維素含量顯著升高含量增幅達(dá)到134.7%，易裂品種紅地球成熟期含量下降增幅為-5.9%。隨著果實(shí)成熟易裂品種在細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶的作用下降解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)多糖，果膠轉(zhuǎn)化為水溶性果膠，纖維素轉(zhuǎn)化為半纖維素，致使角質(zhì)層不平整出現(xiàn)斷口與缺鏈，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，降低了果皮的強(qiáng)度及細(xì)胞壁延伸性，誘導(dǎo)了裂果發(fā)生。