葉勒生·托合達(dá)別克，涂振東，李斌斌，娜迪拉·外力，陳紫蕓，李學(xué)文

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所，烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】甜高粱(Sorghumbicolor)是普通粒用高粱的變異種，一種C4植物，具有生長(zhǎng)快，適應(yīng)能力強(qiáng)，生物學(xué)產(chǎn)量高，光合作用強(qiáng)，其種植范圍廣，具有抗旱、耐貧瘠、耐鹽堿等特性[1-3]。甜高粱具有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，莖稈中富含糖分、纖維素、木質(zhì)素等成分，其中水分和糖分含量比較高，其汁液總糖含量為15%～20%，是理想的制糖原料[4-6]。甜高粱雖然富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但汁液中所含果膠、色素、淀粉及蛋白質(zhì)等膠體物質(zhì)，導(dǎo)致后續(xù)加工及儲(chǔ)存等困難，有必要對(duì)甜高粱汁澄清處理[7-8]。目前，生產(chǎn)中一般采用果膠酶[9]、纖維素酶[10]、半纖維素酶[11]處理原汁，其中，果膠酶是一組能高效降解果膠以及導(dǎo)致渾濁膠體等不溶性物質(zhì)，保證產(chǎn)品良好澄清度酶系[12]。常作用于果蔬汁降低粘度，提高出汁率、澄清度，保證產(chǎn)品良好穩(wěn)定性，具有高效、方便、快捷等特點(diǎn)[13-14]。【前人研究進(jìn)展】朱香澔等[15]采用果膠酶對(duì)甘蔗汁進(jìn)酶解處理，以果膠酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH作為因素，半乳糖醛酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的蔗汁最優(yōu)酶解參數(shù)為：果膠酶用量1.0%、酶解時(shí)間3 h、酶解溫度55℃、酶解pH為2.5，在該條件下甘蔗汁中半乳糖醛酸含量得到了有效降解，酶解效果好。任曼妮等[16]用果膠酶酶解花紅清汁，以出汁率和澄清度最為指標(biāo)，通過(guò)單因素和優(yōu)化后的最佳酶解條件為：果膠酶用量0.06%、酶解時(shí)間90 min、酶解溫度為40℃，此條件下花紅汁出汁率達(dá)到83.7%、透光率達(dá)到87.1%，與對(duì)照組相比顯著提高了花紅汁透光率和出汁率。魯龍[17]對(duì)發(fā)酵前甘蔗汁進(jìn)行果膠酶處理，在最適酶解條件，果膠酶添加量0.25%、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間4 h、pH 4.0時(shí)蔗汁中果膠物質(zhì)被分解，蔗汁澄清度有大幅度提高，透光率達(dá)到80%以上。【本研究切入點(diǎn)】甜高粱汁成分較復(fù)雜，汁液中果膠、色素及膠體物質(zhì)在加工貯藏過(guò)程中易產(chǎn)生沉淀和分層現(xiàn)象，影響甜高粱汁品質(zhì)，果膠酶具有高效、快速、簡(jiǎn)便等特性，有效地降解果蔬中果膠類物質(zhì)，降低粘度、提高澄清度和品質(zhì)。采用果膠酶處理不僅可以保持甜高粱汁營(yíng)養(yǎng)成分，而且可解決易沉淀、粘度大、澄清度低等問(wèn)題，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用果膠酶對(duì)甜高粱汁酶解處理，以單因素試驗(yàn)，研究果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間及pH值對(duì)甜高粱汁的酶解效果，以透光率和粘度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，分析最適酶解工藝，為果膠酶在甜高粱汁酶解澄清提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 甜高粱

2020年10月采收于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能研究所昌吉亞中試驗(yàn)基地。

1.1.2 試劑

果膠酶(20000 U/g),法國(guó)拉氟德公司；福林酚、D-半乳糖醛酸、沒(méi)食子酸，北京索萊寶生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、鹽酸、冰乙酸、硫酸：分析純，天津化學(xué)試劑廠。

1.1.3 儀器

N5000型紫可見(jiàn)分光光度計(jì)，青島精誠(chéng)儀器儀表有限公司；雷磁 PHSJ-4A型pH計(jì)，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；HH-8型多孔恒溫水浴鍋，蘇州市國(guó)飛實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；HR/T16M型高速低溫冷凍離心機(jī)，海楚度儀器設(shè)備有限公司；NDJ-5S數(shù)顯粘度計(jì)，上海聚創(chuàng)儀器有限公司；PAL-1水果糖度計(jì)，日本愛(ài)拓科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 工藝流程

甜高粱→挑選→清洗→榨汁→酶解→滅酶→離心→測(cè)定。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 果膠酶用量對(duì)甜高粱汁透光率和粘度的影響

取6個(gè)燒杯分別裝入100 mL甜高粱汁，分別加入果膠酶，其果膠酶添加量為甜高粱汁的0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%；在40℃下酶解3.5 h,平行試驗(yàn)3組，測(cè)定透光率和粘度。

1.2.2.2 酶解pH值對(duì)甜高粱汁透光率和粘度的影響

取5個(gè)燒杯分別裝入100 mL甜高粱汁，用檸檬酸將pH調(diào)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，加入0.06%的果膠酶，在40℃下酶解3.5 h,平行試驗(yàn)3組，測(cè)定透光率和粘度。

1.2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)甜高粱汁透光率和粘度的影響

取5個(gè)燒杯分別裝入100 mL甜高粱汁，檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4.0，加入0.06%的果膠酶，在40℃下分別酶解2、3、4、5、6 h,平行試驗(yàn)3組，測(cè)定透光率和粘度。

1.2.2.4 酶解溫度對(duì)甜高粱汁透光率和粘度的影響

取5個(gè)燒杯分別裝入100 mL甜高粱汁，檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4.0，加入0.06%的果膠酶，分別在20、30、40、50、60℃下酶解3.5 h,平行試驗(yàn)3組，測(cè)定透光率和粘度。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以果膠酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH為考察因素，透光率(T%)和粘度(mPa.s)作為響應(yīng)值,分析各因素的交互作用對(duì)甜高粱汁酶解效果的影響，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行分析，以Box-Behnken設(shè)計(jì)法，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)。表1

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 透光率

使用N5000型型紫外分光光度計(jì)，以去離子水作為參比，在640 nm波長(zhǎng)下測(cè)定透光率值，用T%表示。

1.2.4.2 粘度

用NDJ-5S數(shù)顯粘度計(jì)測(cè)定。

1.2.4.3 總糖含量

總糖含量參照翁霞等[18]方法測(cè)定，以葡萄糖計(jì)(g/L)。

1.2.4.4 果膠含量

果膠含量參照曹建康等[19]方法測(cè)定，以半乳糖醛酸計(jì)(%)。

1.2.4.5 總酚含量

總酚含量參照趙曉娟等[20]方法測(cè)定，以沒(méi)食子酸計(jì)(μg/mL)。

1.2.4.6 總酸含量

總酸含量按照GB/T 15038-2006[21]方法測(cè)定，以酒石酸計(jì)(g/L)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，由Origin 2019、Design-Expert 8.0、SPSS 25繪圖及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 果膠酶用量對(duì)甜高粱汁透光率和粘度的影響

研究表明，未添加果膠酶時(shí)甜高粱汁透光率為19.10%，隨著果膠酶的添加量增加，甜高粱汁的透光率有大幅度的提升；當(dāng)酶用量為0.06%時(shí)，透光率到達(dá)85%；隨后再增加果膠酶的量對(duì)透光率的影響很少，透光率趨于穩(wěn)定；甜高粱汁的粘度隨著果膠酶添加量的增加而降低，當(dāng)果膠酶添加量為0.06%時(shí)，甜高粱汁粘度降至1.32 mPa.s，并隨果膠酶的繼續(xù)添加，汁液粘度變化不明顯。由于存在果膠類物質(zhì)導(dǎo)致汁液渾濁，流動(dòng)性差，粘度大，加入果膠酶以后可以有效的降解這類物質(zhì)，降低粘度，提高透光率，酶有它自身的適宜濃度，過(guò)大過(guò)小對(duì)反應(yīng)沒(méi)有影響，果膠酶添加量0.06%為宜。圖1

圖1 不同果膠酶添加量下透光率和粘度變化

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)甜高粱汁透光率和粘度影響

研究表明，隨著酶解作用時(shí)間的延長(zhǎng)，甜高粱汁的透光率呈先增大后下降的趨勢(shì)，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，透光率最高為84.8%;甜高粱汁的粘度隨反應(yīng)時(shí)間而持續(xù)的減少，當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，粘度降至最小為1.34 mPa.s，4 h以后甜高粱汁的粘度趨于穩(wěn)定狀態(tài)；過(guò)長(zhǎng)酶解時(shí)間，不利于酶解，會(huì)造成影響營(yíng)養(yǎng)成分損失以及影響風(fēng)味物質(zhì)，果膠酶適宜的酶解時(shí)間為4 h。圖2

圖2 不同酶解時(shí)間下透光率和粘度變化

2.1.3 酶解溫度對(duì)甜高粱汁透光率和粘度的影響

研究表明，當(dāng)酶解溫度低于50℃時(shí)，甜高粱汁的透光率有上升的趨勢(shì)，在50℃時(shí)透光率達(dá)到最高值86%，繼續(xù)升高溫度透光率反而開(kāi)始下降；甜高粱汁的粘度隨反應(yīng)溫度有下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，降到最低值1.28 mPa.s，當(dāng)反應(yīng)溫度在50℃以上時(shí)，甜高粱汁粘度有上升的趨勢(shì)；酶解溫度不宜超過(guò)50℃。圖3

圖3 不同酶解溫度下透光率和粘度變化

2.1.4 酶解pH對(duì)甜高粱汁透光率和粘度影響

研究表明，當(dāng)酶解pH小于4.0時(shí)，甜高粱汁透光率隨著反應(yīng)物的pH升高有大幅度的提高，當(dāng)汁液pH為4.0至5.0時(shí)，透光率有小幅度的下降，當(dāng)汁液pH為4.0時(shí)，經(jīng)過(guò)測(cè)定透光率達(dá)到最高86.30%；當(dāng)pH低于4.0時(shí)，甜高粱汁粘度具有下降的趨勢(shì)，酶解pH為4.0時(shí)，甜高粱汁粘度為最低1.39 mPa.s，隨著pH的升高，汁液粘度有小幅度的上升。酶有它適宜的pH范圍，超過(guò)該范圍，酶的活性也受到抑制，最適pH為4.0。圖4

圖4 不同酶解pH下透光率和粘度變化

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面模型建立及回歸方差分析(表1)

研究表明，甜高粱汁的透光率和粘度的二次回歸方程如下：

甜高粱汁透光率回歸方程：

Y1=85.35+1.33A+0.38B+0.54C+1.27D+1.82AB+0.26AC-0.90AD-0.53BC-0.71BD+0.25CD-3.52A2-3.32B2-1.97C2-1.74D2.

甜高粱汁粘度回歸方程：

Y2=1.24-0.049A-0.038B-0.023C-0.072D-0.045AB-0.020AC+0.003AD+0.002BC+0.068BD-0.025CD+0.20A2+0.11C2+0.13D2.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

模型F值為6.05，P<0.000 1,模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)；模型決定系數(shù)R2=0.952 4，此回歸模型擬合度良好，可以很好的反映響應(yīng)值與自變量之間的關(guān)系。一次項(xiàng)中A、B對(duì)透光率有極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)的影響；二次項(xiàng)中A2、B2、C2對(duì)透光率影響極顯著(P<0.01)，D2影響顯著(P<0.05)；交互項(xiàng)AB的影響顯著(P<0.05)，其余交互項(xiàng)則不顯著。各因素對(duì)甜高粱汁透光率的影響程度為：A(果膠酶添加量)>D(酶解pH)>C(酶解溫度)>B(酶解時(shí)間)。表3

表3 透光率回歸模型方差

粘度回歸模型F=12.10，P值<0.000 1極顯著,失擬項(xiàng)0.162 2>0.05不顯著，模型回歸系數(shù)R2=0.923 7，建立的此模型擬合良好，可用此模型對(duì)透光率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)A 、B對(duì)響應(yīng)值影響顯著(P<0.05)，D達(dá)到極顯著(P<0.01)，交互項(xiàng)BD顯著(P<0.05)，A2、B2、C2、D2二次項(xiàng)均為極顯著(P<0.01)。各因素對(duì)粘度的影響依次：D(酶解pH)>A(果膠酶添加量)>B(酶解時(shí)間)>C(酶解溫度)。表4

表4 粘度回歸模型方差

2.2.2 響應(yīng)面交互

研究表明，響應(yīng)面3D和等高線圖更直觀的反映各自變量與響應(yīng)值之間的顯著關(guān)系，曲面越陡或等高線越橢，表示更加顯著，等高線趨于圓形或曲面較平緩則與之相反。在各因素水平范圍內(nèi)，隨著酶用量的增加，透光率先上升后降的趨勢(shì)，AB、AC、AD、BC、BD、CD等交互因素中AB交互作用最顯著，曲面較陡，等高線橢圓形好，果膠酶用量與酶解時(shí)間對(duì)響應(yīng)值交互作用較強(qiáng)，對(duì)透光率影響顯著；其余果膠酶用量與酶解溫度、酶用量與酶解pH、酶解時(shí)間與酶解溫度、酶解時(shí)間與酶解pH、酶解溫度與酶解pH等交互因素等高線圖趨于圓形，曲面較平緩，交互作用較弱，對(duì)響應(yīng)值影響小。圖5

a.果膠酶添加量與酶解時(shí)間

響應(yīng)值最低點(diǎn)出現(xiàn)在等高線中心區(qū)域，由中心向邊緣逐漸升高，隨酶用量的增加，粘度呈先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度固定在50℃時(shí)，BD兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值有較大影響，即酶解時(shí)間與酶解pH對(duì)粘度影響顯著(P<0.05)。(a)、(b)、(c)、(d)(f)的等高線圖趨于近橢形，雖然各因素對(duì)甜高粱汁粘度存在影響，但交互作用并不顯著(P>0.05)。酶解時(shí)間與酶解pH兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響顯著，其余均不顯著，與方差分析結(jié)果一致。圖6

a.果膠酶添加量與酶解時(shí)間

2.2.3 最佳酶解工藝條件驗(yàn)證

研究表明，最佳酶解工藝條件為：果膠酶添加量0.057%、酶解時(shí)間4.08 h、酶解溫度51.64℃、酶解pH 4.18，在該條件下透光率為85.71%、粘度為1.23 (mPa·s)，便于實(shí)際操作將各項(xiàng)參數(shù)修正為：果膠酶用量0.06%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間4 h、酶解pH 4.0。甜高粱汁實(shí)際透光率為：85.54%，粘度為：1.30 mPa.s，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值非常接近，模型可以較好地反映甜高粱汁酶解工藝，工藝參數(shù)是可行的。

2.3 甜高粱汁酶解前后理化指標(biāo)對(duì)比

研究表明，對(duì)甜高粱汁進(jìn)行酶解處理后，有效的降解了汁液中的果膠物質(zhì)，果膠含量從0.10%降到了0.013%，其粘度由3.61 mPa.s降至1.30 mPa.s，使汁液澄清度大范圍的提高，透光率由19%上升至85.54%,經(jīng)過(guò)酶解處理很好的保持了汁液中的營(yíng)養(yǎng)成分。表5

表5 酶解前后理化指標(biāo)對(duì)比

3 討 論

甜高粱汁透光率隨果膠酶用量先上升后趨于穩(wěn)定，而粘度下降較明顯，降到一定程度后趨于平緩，當(dāng)酶用量到某種程度時(shí)，酶活力達(dá)到飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加酶的用量對(duì)底物作用較少，甚至?xí)种品磻?yīng)[23]。酶有自身適宜的溫度，一旦超過(guò)該溫度，酶的活性受影響，試驗(yàn)中透光率出現(xiàn)先增大后下降的現(xiàn)象，在50℃達(dá)到了最好的酶解效果。在適宜的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)酶解效率高，過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)的酶解時(shí)間都會(huì)抑制酶的活性，甜高粱汁在4 h時(shí)達(dá)到了較高的酶解水平。每一種酶有適宜的pH值，在適宜的pH范圍內(nèi)具有較好的酶解效率，在研究pH因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，底物pH值在4.0時(shí)，澄清度較高，粘度較低，判斷該點(diǎn)為果膠酶適宜pH值。

果膠酶作用于果蔬汁，會(huì)使果汁中的果膠發(fā)生部分水解后，原包裹于內(nèi)在的帶正電的荷的蛋白質(zhì)顆粒被暴露出來(lái)，和其它帶負(fù)電荷的粒子碰撞，從而導(dǎo)致絮凝的發(fā)生，這些絮凝物在沉降過(guò)程中會(huì)吸附、纏繞果汁中的其它懸浮物，再經(jīng)過(guò)濾、離心等步驟將去除，從而達(dá)到澄清的目的[24]。陳健旋[25]用果膠酶澄清甘蔗汁的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)酶解后甘蔗汁透光率由5%提高到了95%，使粘度從3.39 mPa.s降至1.1 mPa.s，酶促澄清效果明顯于自然澄清。吳慶智等[26]采用果膠酶酶解石榴汁，利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，在最優(yōu)酶解工藝條件下，石榴汁透光率為95.31%，花色苷保留率為82.15%，石榴汁營(yíng)養(yǎng)成分保留的較好。

4 結(jié) 論

甜高粱汁最佳酶解工藝參數(shù)為：果膠酶用量0.06%、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度50℃、酶解pH值4.0。此時(shí)甜高粱汁的透光率為85.54%、粘度為1.30 mPa.s，與模型預(yù)測(cè)值接近，吻合度高，優(yōu)化組與對(duì)照組各營(yíng)養(yǎng)成分含量無(wú)明顯差異。果膠酶酶解不僅保留了原汁營(yíng)養(yǎng)成分，且降低汁液粘度，提高了澄清度，達(dá)到了理想的酶解效果。