吳巧玉，何天久

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴陽(yáng) 550006)

0 引 言

【研究意義】紫色甘薯富含花青素[1-2]。紫色甘薯的主要用途為鮮食、提取色素、加工全粉和加工休閑食品等[3]。貴州省紫色甘薯品種來(lái)源分為本地選育和引進(jìn)。作物的生長(zhǎng)發(fā)育受環(huán)境及固有基因相互影響，一些引進(jìn)的紫色甘薯在貴州種植時(shí)產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀可能會(huì)出現(xiàn)不同程度差異，對(duì)引進(jìn)的紫色甘薯新品種開(kāi)展生物學(xué)形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，篩選適宜品種及親本，對(duì)發(fā)展貴州省紫色甘薯具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】黃萍等[4]分析對(duì)貴州地方品種及引進(jìn)品種形態(tài)聚類，宋吉軒等[5]對(duì)貴州紫心甘薯進(jìn)行形態(tài)標(biāo)記聚類分析，李慧峰等[6]對(duì)廣西地方甘薯品種進(jìn)行形態(tài)標(biāo)記分類。采用形態(tài)學(xué)來(lái)區(qū)分遺傳變異和種屬之間的差別方法最直接簡(jiǎn)便，但是形態(tài)學(xué)研究方法具有一定的局限性，容易受到人為因素和環(huán)境因素的影響，難以區(qū)分親緣關(guān)系較近的材料，需結(jié)合其他方法對(duì)材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析[7-8]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有引物設(shè)計(jì)容易，操作簡(jiǎn)單，多態(tài)性好，可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，在作物種質(zhì)資源鑒定、分類及親緣關(guān)系分析等中有重要的應(yīng)用[9]。ISSR技術(shù)具有較高的分辨力，在賀學(xué)勤等[10]、李強(qiáng)等[11]的甘薯遺傳多樣性研究中得到肯定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，對(duì)甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行的研究，多是利用形態(tài)學(xué)性狀對(duì)甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定分類，盡管分子標(biāo)記在品種鑒別上發(fā)揮重要作用, 但目前分子標(biāo)記仍未能取代形態(tài)學(xué)性狀, 將兩者結(jié)合起來(lái)更利于品種之間的遺傳關(guān)系。目前國(guó)內(nèi)少見(jiàn)利用形態(tài)學(xué)及分子標(biāo)記同時(shí)對(duì)紫色甘薯親緣關(guān)系進(jìn)行綜合分析。需分析紫色甘薯品種的遺傳多樣性，其遺傳差異。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用形態(tài)學(xué)性狀和ISSR熒光標(biāo)記，分析引進(jìn)的10份紫色甘薯品種進(jìn)行遺傳多樣性，為貴州省紫色甘薯種質(zhì)資源新品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料為從西南大學(xué)引進(jìn)7份紫色甘薯，山東引進(jìn)2份，江蘇引進(jìn)1份，種植于貴州省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所試驗(yàn)基地。表1

表1 甘薯材料名稱及來(lái)源

1.2 方 法

1.2.1 形態(tài)學(xué)表型性狀調(diào)查

材料于2020年5月在貴州省農(nóng)科院試驗(yàn)基地種植，每個(gè)品種以10株為樣本, 按農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T 2939-2016[12]觀察、測(cè)量、記載20項(xiàng)形態(tài)學(xué)性狀，取平均值。

1.2.2 基因組DNA提取

參照李強(qiáng)等[11]的甘薯基因組 DNA 提取方法，DNA提取試劑盒(擎科生物通用型)。

1.2.3 引物篩選及PCR檢測(cè)

使用加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第9套ISSR引物序列，由擎科生物科技有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系各組分：2×TSINGKE Master Mix(blue) 10 μL；10 μM Primer 1 μL；Template(gDNA)1 μL；ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性1個(gè)循環(huán)(94℃ 5 min); 循環(huán)階段35個(gè)循環(huán)(94℃30s，TM℃ 30s, 72℃ 30s)；延伸階段1個(gè)循環(huán)(72℃ 5 min)。擴(kuò)增產(chǎn)物在3730測(cè)序儀(ABI 3730xl遺傳分析儀)進(jìn)行毛線管電泳，篩選出多態(tài)性較好的位點(diǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

形態(tài)學(xué)聚類分析采用唐啟義等[13]方法基于運(yùn)用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，歐式距離和類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

遺傳多樣性分析在GenAlEx version 6.501和GenePop version 4.14軟件中，分別計(jì)算ISSR位點(diǎn)的各項(xiàng)遺傳多樣性指標(biāo)，包括觀測(cè)等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、期望雜合度(He)、香農(nóng)指數(shù)(I)。

ISSR聚類分析利用 NTSYSpc 2.1 軟件對(duì)10份供試材料進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫色甘薯形態(tài)學(xué)性狀測(cè)量、編碼結(jié)果、形態(tài)學(xué)聚類

研究表明，在歐式距離為9.97處，可分為獲得兩大類群，類群Ⅰ包括 5個(gè)品種，分別為鄂12、寧紫4號(hào)、渝紫3號(hào)、渝紫11、南紫018；類群Ⅱ可包括其余 5個(gè)品種，分別為寧紫1號(hào)、山東紫薯、渝紫2號(hào)、徐紫8號(hào)、越南紫薯。

類群Ⅰ被分為2個(gè)亞群，第一亞群3個(gè)品種，分別為鄂12、寧紫4號(hào)、渝紫3號(hào)；第二個(gè)亞群2個(gè)品種，分別為渝紫11和南紫018。類群Ⅱ主要形態(tài)特征為頂芽色和頂葉色紫/淡紫，頂葉葉緣色紫，葉尖性狀銳，葉色綠，節(jié)間長(zhǎng)短，主蔓長(zhǎng)短，薯皮薯肉紫/深紫。

類群Ⅱ被分為4個(gè)小類，其中寧紫1號(hào)和山東紫薯被聚在一起，兩者親緣關(guān)系較近。這一類群與第Ⅰ類群最大區(qū)別為葉脈全綠，第Ⅰ類群葉脈紫、部分紫、全部紫。表2，表3，圖1

表2 甘薯形態(tài)標(biāo)記及編碼

表3紫薯甘薯形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

圖1 紫薯甘薯形態(tài)標(biāo)記的聚類

2.2 紫色甘薯材料ISSR的多態(tài)性

研究表明，等位基因(Na)平均為2個(gè)；有效等位基因數(shù)(Ne)平均為1.919 0；期望雜合度(He)平均為0.237 5；香農(nóng)指數(shù)(I)平均0.433 3。供試的紫色甘薯遺傳多樣性較豐富。表4

表4 引物序列及擴(kuò)增條帶

2.3 紫色甘薯材料ISSR熒光標(biāo)記的聚類

研究表明，在遺傳距離為 0.96處，供試材料可分為兩大類。類群Ⅰ包括6份材料，分別為：寧紫薯1號(hào)、鄂12、渝紫薯3、徐紫8號(hào)、山東紫薯；類群Ⅱ包括4個(gè)甘薯品種，分別是渝紫11、南紫018、寧紫薯4號(hào)、越南紫薯。

在遺傳距離為0.68處，類群Ⅰ被分為兩個(gè)亞類，第一個(gè)亞類寧紫薯1號(hào)、鄂12、渝紫薯3、渝紫薯2號(hào)；第二個(gè)亞類有徐紫8號(hào)和山東紫薯。其中鄂12和渝紫薯3，徐紫8號(hào)和山東紫薯被聚在一起，表現(xiàn)出更緊密的親緣關(guān)系。

在遺傳距離為0.46處，類群Ⅱ被分為兩個(gè)亞類，渝紫11、南紫018和寧紫薯4號(hào)為一個(gè)亞類，越南紫薯單獨(dú)為一個(gè)亞類。圖2

圖2 基于ISSR熒光標(biāo)記的紫色甘薯聚類

3 討 論

形態(tài)學(xué)性狀的表現(xiàn)是基因型和環(huán)境互作的結(jié)果, 其最大特點(diǎn)是直觀性強(qiáng)，可區(qū)分不同的表型個(gè)體，在傳統(tǒng)育種過(guò)程中仍是主要的研究手段[14]。研究中大部分材料被形態(tài)學(xué)聚類圖上被聚到一類的材料在ISSR分子標(biāo)記聚類圖上也被聚在一個(gè)類群中，如寧紫1號(hào)、山東紫薯、渝紫薯2號(hào)、徐紫8號(hào)在兩類聚類圖中都被聚在一個(gè)大類；寧紫4號(hào)、渝薯11、南紫018在兩類聚類圖中也被聚在一個(gè)大類。部分供試材料的形態(tài)學(xué)標(biāo)記與ISSR標(biāo)記聚類結(jié)果在類群劃分與遺傳背景上具有一致性。而越南紫薯、鄂12、渝紫3號(hào)這3份材料在兩類聚類圖種出現(xiàn)在不同類別。部分供試材料的形態(tài)學(xué)標(biāo)記與ISSR標(biāo)記聚類結(jié)果并不完全一致。劉洪等[15]研究認(rèn)為，在理論上要完全尋找與形態(tài)學(xué)性狀高度相關(guān)的SSR 標(biāo)記存在很大難度。許文停等[16]研究發(fā)現(xiàn)，湖南牡丹種質(zhì)資源的形態(tài)學(xué)聚類結(jié)果與 ISSR 分子標(biāo)記聚類結(jié)果并不完全一致；王鵬等[17]研究結(jié)果表明，部分馬鈴薯種質(zhì)材料的形態(tài)學(xué)標(biāo)記聚類結(jié)果與SSR標(biāo)記聚類結(jié)果的表現(xiàn)不完全一致；劉洪等[15]通過(guò) Mantel 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花生品種間的形態(tài)學(xué)性狀相似系數(shù)與 SSR 標(biāo)記相似系數(shù)的相關(guān)性很弱。

研究中形態(tài)性狀聚類分析中，寧紫1號(hào)和山東紫薯被聚在一起，而在ISSR標(biāo)記分析種將兩者分在不同亞類；在分子標(biāo)記聚類圖中，南紫018和寧紫4號(hào)被聚在一起，在形態(tài)分析聚類聚圖中將兩者分在不同亞類。

4 結(jié) 論

在歐式距離為9.97處，可將10份紫色甘薯分為獲得兩大類群；在遺傳距離為 0.96處，供試材料可分為兩大類群。部分紫色甘薯供試材料的ISSR標(biāo)記聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)標(biāo)記在遺傳背景和類群劃分上具有一致性，但是兩種鑒定分類方法的聚類分析結(jié)果也存在一定差異，將形態(tài)學(xué)及ISSR標(biāo)記結(jié)合能有效提高品種間特異性的鑒定，更能客觀、準(zhǔn)確的確定種質(zhì)資源的親緣關(guān)系。