劉亞西，周 楊，李 楊，劉金平，王 丹

（西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 南充 637009）

多年生黑麥草(Lolium perenne)為禾本科黑麥草屬草本植物，為典型的冷季型草坪草，兼具坪用和飼用價(jià)值，一直以來(lái)都是草坪建植和牧草栽培的優(yōu)良草種之一[1-2]。種子萌發(fā)作為植物生活史的第一個(gè)階段，種子的萌發(fā)易受到許多外界因素的影響，澇害、干旱、鹽堿地等都影響種子的萌發(fā)[3]。在其他環(huán)境條件適宜的情況下，種子萌發(fā)最容易受到水分的影響，水分過(guò)多或過(guò)少都會(huì)對(duì)種子的萌發(fā)造成影響[4-5]。

種子萌發(fā)是有序的生理過(guò)程，當(dāng)萌發(fā)環(huán)境中水分含量過(guò)少時(shí)，細(xì)胞膜系統(tǒng)被破壞，內(nèi)含物外滲，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及酶活性都受到影響，進(jìn)而影響種子的萌發(fā)[6]。當(dāng)萌發(fā)環(huán)境中水分含量過(guò)多時(shí)，同樣會(huì)抑制種子萌發(fā)過(guò)程中正常的代謝活動(dòng)，種子淹水時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，缺少氧氣時(shí)進(jìn)行無(wú)氧呼吸影響正常生長(zhǎng)發(fā)育[7]。在淹水脅迫下，種子因缺氧進(jìn)行無(wú)氧呼吸，使得種子中積累了大量的有害物質(zhì)(如乙醇)，從而限制了種子的萌發(fā)[8]。種子的主要成分是淀粉，因此種子的萌發(fā)過(guò)程實(shí)際上主要是淀粉的分解過(guò)程。而淀粉的分解是由多種酶共同作用的結(jié)果[9]，其中α-淀粉酶作為主要的酶類(lèi)參與淀粉的水解[10]。有研究表明，淀粉含量與種子的發(fā)芽特性指標(biāo)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而α-淀粉酶活性則剛好相反[11]。因此淀粉含量和α-淀粉酶活性能夠很好地反映種子的萌發(fā)情況。淹水和干旱脅迫會(huì)影響植物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，維持活性氧代謝平衡、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的功能，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)的含量發(fā)生改變[12]。

本研究對(duì)黑麥草種子進(jìn)行不同程度的水分脅迫處理，分析其種子萌發(fā)的吸水特性以及受到的影響，探討淹水和干旱脅迫對(duì)黑麥草種子萌發(fā)、無(wú)氧呼吸、淀粉酶活性和抗氧化酶特性等方面的影響，對(duì)了解黑麥草種子萌發(fā)過(guò)程中水分代謝的規(guī)律以及水分合理利用和高效生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試多年生黑麥草品種為‘雅晴’(Yatsyn)，種子購(gòu)自百綠國(guó)際草業(yè)有限公司(種子于2019 年生產(chǎn)，發(fā)芽率為90%，千粒重為1.752 5 g)。聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG-6000)為化學(xué)純，生產(chǎn)廠家為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)處理

選取健康飽滿且大小一致的黑麥草種子，置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)[10]進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，種子吸水試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照(CK，蒸餾水)、10% PEG (T1)、15% PEG(T2)、20% PEG (T3)、淹水(T4)共5 個(gè)水分處理，種子萌發(fā)試驗(yàn)設(shè)置CK、T1、T2、T4共4 個(gè)水分處理(因預(yù)試驗(yàn)中T3處理下種子發(fā)芽率僅為8%)，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放置50 粒種子。利用PEG-6000 溶液模擬干旱脅迫，溶液配制方法參考Michel和Kaufmann[13]，3 種PEG 濃度(10%、15%、20%)對(duì)應(yīng)水勢(shì)分別為?0.2、?0.4 和?0.6 MPa[14]。淹水處理在每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)加入15 mL 蒸餾水使得種子剛好淹沒(méi)在水中，其余處理的培養(yǎng)皿內(nèi)加入5 mL 相應(yīng)處理液，每天定時(shí)以稱重法補(bǔ)充散失水分以維持培養(yǎng)皿內(nèi)水勢(shì)的恒定。種子吸水和萌發(fā)試驗(yàn)在恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光照/黑暗時(shí)間為12 h/12 h，溫度25 ℃，相對(duì)濕度為80%。每天在同一時(shí)間段統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的種子數(shù)，以胚根伸長(zhǎng)為種子長(zhǎng)度的1/2 視為發(fā)芽。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1吸水指標(biāo)測(cè)定

種子放入光照培養(yǎng)箱之前對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)的種子稱重，即為種子的初始重量。放入培養(yǎng)箱之后前期每隔3 h 取出種子用濾紙吸干表面水分后稱重，12 h 后每隔6 h 取出種子稱重，直到48 h。根據(jù)公式計(jì)算種子的吸水量、吸水率和吸水速率。

吸水量 =Wt?Wo；

吸水率 = (Wt?Wo) /Wo× 100%。

式中：Wt為種子吸水后的重量，Wo為種子初始重量。吸水速率 = (Wt?Wt?1) /H。

式中：Wt?1為前一個(gè)階段種子質(zhì)量，H為間隔時(shí)間。

1.3.2 種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

于種子萌發(fā)吸水48 h 后測(cè)定乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)活性，種子萌發(fā)第3 天測(cè)定淀粉含量、α-淀粉酶活性。第5 天測(cè)定發(fā)芽勢(shì)，第12天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束從每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取10 株幼苗用直尺測(cè)量株高、根長(zhǎng)。種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)具體計(jì)算方法如下：

發(fā) 芽 勢(shì) = (第5 天 發(fā) 芽 種 子 數(shù)/供 試 種 子 數(shù)) ×100%；

發(fā)芽率 = (第12 天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)) ×100%； ∑

發(fā)芽指數(shù)(germination index,GI) = (Gt/Dt)。式中：Gt為在時(shí)間t內(nèi)的發(fā)芽個(gè)數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)[15]。

發(fā)芽結(jié)束后測(cè)定SOD、POD、CAT 酶活性，淀粉含量、α-淀粉酶活性、ADH、SOD、POD、CAT 酶活性均采用蘇州格銳思生物科技公司的試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和制圖，應(yīng)用SPSS 22.0 軟件采用單因素方差分析方法(ANOVA)對(duì)各觀測(cè)指標(biāo)平均值進(jìn)行分析，利用DUNCAN 方法對(duì)各指標(biāo)平均值進(jìn)行差異顯著性分析(P＜ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑麥草種子萌發(fā)吸水動(dòng)態(tài)特性

不同水分脅迫下吸水量和吸水率變化趨勢(shì)基本一致，大致可分為3 個(gè)階段(圖1)。第1 階段是0～24 h；第2 階段是24 ～ 36 h；第3 階段是36 h 之后，種子吸水逐漸趨于飽和，48 h 時(shí)CK 處理部分種子開(kāi)始萌發(fā)。對(duì)不同水分處理下黑麥草種子的最終吸水量和吸水率進(jìn)行差異性分析顯示(表1)，T4和CK 處理下的吸水量和吸水率無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)，但干旱與CK 處理間差異顯著 (P＜ 0.05)。隨著PEG濃度的增加，種子的吸水量和吸水率逐漸下降，20%PEG 脅迫處理時(shí)種子的吸水量和吸水率最低，與CK 相比降低了28.65%和29.34%，且與T1、T2處理間差異顯著(P＜ 0.05)。在不同水分處理下黑麥草種子的吸水速率在前3 h 達(dá)到最大值，之后逐漸下降并慢慢趨于穩(wěn)定。

表1 不同水分脅迫對(duì)黑麥草種子最終吸水量和吸水率的影響Table 1 Effects of different water stress treatments on final water quantity and water absorption by ryegrass seeds

圖1 不同水分脅迫對(duì)黑麥草種子萌發(fā)吸水特性的影響Figure 1 Effects of different water stress treatments on germination and water absorption characteristics of ryegrass seeds

2.2 不同水分脅迫處理對(duì)黑麥草種子萌發(fā)的影響

水分脅迫對(duì)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率有顯著影響(P＜ 0.05) (表2)。發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率隨著PEG 濃度的增加而降低，10% PEG 處理與CK 之間無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)，15% PEG 處理的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率比CK 分別降低了25.27%和24.21%。淹水處理下種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均與CK 存在顯著差異(P＜ 0.05)，但都與15% PEG 處理無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)。干旱和淹水都顯著影響種子的發(fā)芽指數(shù)，隨著干旱程度的增加發(fā)芽指數(shù)越小，但T2和T4處理間無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)。干旱抑制了黑麥草幼苗的生長(zhǎng)，10%PEG、15% PEG 與CK 相比差異顯著，分別降低了24.49%和37.75%；T4處理下株高與CK 相比顯著降低(P＜ 0.05)，但與T1處理間無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)。根長(zhǎng)隨著PEG 濃度的增加表現(xiàn)為先減小后上升的趨勢(shì)，T1處理下的根長(zhǎng)略低于對(duì)照且無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)，T2處理比CK 提高了39.89%。

表2 不同水分脅迫對(duì)黑麥草種子萌發(fā)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of different water stress treatments on germination indexes of ryegrass seeds

2.3 不同水分脅迫處理對(duì)黑麥草種子萌發(fā)過(guò)程中乙醇脫氫酶活性的影響

種子吸水48 h 后，各脅迫處理間的乙醇脫氫酶(ADH)活性表現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)(圖2)。T4處理顯著提高了乙醇脫氫酶活性(P＜ 0.05)，與對(duì)照相比增加了50.62%，而T1、T2和CK 處理之間無(wú)顯著性差異(P＞ 0.05)。T4與T1、T2處理相比，ADH 活性顯著提高了50.15%、43.03% (P＜ 0.05)。淹水脅迫(T4)處理，ADH 酶活性大于CK 處理，表明種子處于淹水中缺氧逆境條件下，為了維持短期的生活機(jī)能，將會(huì)進(jìn)行無(wú)氧呼吸，使ADH 酶活性增強(qiáng)。

圖2 不同水分脅迫對(duì)黑麥草種子乙醇脫氫酶活性的影響Figure 2 Effects of different water stress treatments on alcohol dehydrogenase activity in ryegrass seeds

2.4 不同水分脅迫處理對(duì)黑麥草種子萌發(fā)淀粉含量和α-淀粉酶活性的影響

CK 處理的黑麥草種子的α-淀粉酶活性最高，干旱和淹水處理下α-淀粉酶活性表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)(圖3)，T1處理下與CK 相比沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，T2和T4處理與CK 相比α-淀粉酶活性顯著降低(P＜ 0.05)，分別降低了73.19%和78.01%。與CK 相比，T1處理下淀粉含量增加，但二者無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)，T2和T4處理下淀粉含量都顯著高于CK (P＜ 0.05)，分別高于對(duì)照38.77%和39.90%。表明15% PEG 干旱處理(T2)和淹水脅迫(T4)都抑制了種子萌發(fā)過(guò)程中淀粉酶的活性，進(jìn)一步影響種子的萌發(fā)過(guò)程中淀粉的代謝。

圖3 不同水分脅迫對(duì)黑麥草種子α-淀粉酶活性和淀粉含量的影響Figure 3 Effects of different water stress treatments on α-amylase activity and starch content in ryegrass seeds

2.5 不同水分脅迫處理對(duì)黑麥草種子萌發(fā)抗氧化酶活性的影響

與CK 相比不同水分脅迫處理下，3 種抗氧化酶活性均表現(xiàn)出顯著增高的相同變化趨勢(shì)(P＜ 0.05)(圖4)。與CK 相比，T1、T2和T4處理均顯著促進(jìn)了SOD 酶活性(P＜ 0.05)，分別增加了54.96%、57.24%和59.50%。與CK 相比，T1、T2和T4處理均顯著促進(jìn)了POD 酶活性(P＜ 0.05)，分別增加了40.16%、41.54%和47.59%。與CK 相比，T1、T2和T4處理均顯著促進(jìn) 了CAT 酶 活 性(P＜ 0.05)，分 別 增 加 了52.63%、54.58%和55.29%。在本研究處理的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，T1、T2、T4處理之間3 種抗氧化酶活性均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。表明PEG 干旱處理(T1、T2)和淹水脅迫(T4)均顯著影響了種子萌發(fā)正常的生理代謝，植物通過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)適應(yīng)脅迫環(huán)境。

圖4 不同水分脅迫對(duì)黑麥草種子抗氧化酶活性的影響Figure 4 Effects of different water stress treatments on antioxidant enzyme activities of ryegrass seeds

3 討論與結(jié)論

在黑麥草種子萌發(fā)吸水動(dòng)態(tài)試驗(yàn)中，不同水分脅迫下各組吸水量和吸水率動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本相同，吸水量和吸水率逐漸增加，36 h 后種子的吸水量和吸水率逐漸趨于穩(wěn)定。PEG 能使植物處于類(lèi)似于干旱的環(huán)境中，可用來(lái)模擬干旱脅迫[16]。本研究中隨著PEG 濃度的增高和干旱脅迫程度的增加，吸水量和吸水率降低。在CK 處理下，48 h 黑麥草種子的吸水量占種子干重的66.72%，吸水率達(dá)到1.34%時(shí)種子開(kāi)始萌發(fā)，而不同PEG 脅迫下的黑麥草種子萌發(fā)時(shí)間延遲。說(shuō)明干旱是通過(guò)抑制黑麥草種子的吸水量和吸水率從而影響種子的萌發(fā)。有研究表明，對(duì)種子萌發(fā)吸水量的測(cè)定可為種子浸種時(shí)間的確定提供一定的依據(jù)[17]。短期的淹水脅迫對(duì)種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)不會(huì)產(chǎn)生很大影響，但長(zhǎng)期淹水脅迫會(huì)降低種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)[18]。干旱在生產(chǎn)中可導(dǎo)致延遲或不均勻的種子萌發(fā)，本研究中干旱脅迫抑制黑麥草種子萌發(fā)，隨著干旱脅迫的增加，黑麥草種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)都顯著降低。

植物應(yīng)對(duì)水分脅迫通過(guò)多種途徑，包括調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)、能量代謝、光合作用、呼吸作用和內(nèi)源激素的變化等[19]。種子萌發(fā)過(guò)程中，完成吸脹吸水后，代謝相關(guān)酶活化，呼吸作用為萌發(fā)過(guò)程的各種代謝活動(dòng)提供能量。種子在環(huán)境缺氧條件下，進(jìn)行無(wú)氧呼吸，ADH 酶活性增加。長(zhǎng)期進(jìn)行無(wú)氧呼吸，使細(xì)胞內(nèi)乙醛、乙醇和乳酸含量大量積累，ATP 合成減少，養(yǎng)分吸收下降，會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成傷害，使植物生長(zhǎng)受到抑制。 Brownstein 等[20]研究了淹水與厭氧代謝相關(guān)的酶的關(guān)系，結(jié)果表明在淹水處理下鹽堿草甸物種都表現(xiàn)出顯著增加的ADH 活性。這與本研究結(jié)果一致，在淹水處理下ADH 活性顯著高于PEG和CK 處理，而PEG 和CK 處理間ADH 活性無(wú)顯著差異。有些植物的種子在淹水環(huán)境中萌發(fā)效果較好，如水稻(Oryza sativa)、蘆葦(Phragmites australis)等，在缺氧環(huán)境中，ADH 代謝在種子萌發(fā)和植物存活中起著至關(guān)重要的作用[21]。本研究中淹水處理下ADH 酶活性升高，表明淹水處理干擾了種子正常的呼吸代謝作用，誘導(dǎo)無(wú)氧呼吸的產(chǎn)生，影響正常的代謝，使植株生長(zhǎng)顯著低于CK 處理。

種子的萌發(fā)過(guò)程需要將種子貯藏物淀粉和蛋白質(zhì)通過(guò)酶轉(zhuǎn)化為生長(zhǎng)發(fā)育所需要的糖類(lèi)，例如淀粉的分解代謝[22]。本研究中淹水或干旱處理淀粉的含量都顯著高于CK，α-淀粉酶活性顯著低于CK。這與在干旱脅迫下，PEG 脅迫顯著抑制了黃瓜(Cucumis sativus)種子[23]和莧菜(Amaranthus tricolor)種子[24]的α-淀粉酶活性，使得種子具有較高的淀粉含量的研究結(jié)果一致。稻谷可以在淹水條件下發(fā)芽，而大多數(shù)其他谷類(lèi)則沒(méi)有類(lèi)似的表現(xiàn)，在淹水的情況下，由于α-淀粉酶的成功產(chǎn)生，稻谷降解淀粉的能力可能是使水稻在厭氧條件下發(fā)芽的因素之一[25]。本研究中淹水處理和干旱處理間α-淀粉酶活性無(wú)顯著性差異，同時(shí)顯著低于CK，說(shuō)明黑麥草淹水和干旱脅迫處理都表現(xiàn)為顯著抑制α-淀粉酶活性，降低淀粉的代謝速率，使得種子中具有較高的淀粉含量，影響種子的能量轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步影響種子萌發(fā)。

水分脅迫使植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧，干擾正常的生命代謝活動(dòng)[26]。但植物對(duì)逆境的響應(yīng)會(huì)產(chǎn)生自我保護(hù)的抗氧化酶，SOD、POD、CAT 分別通過(guò)催化超氧化物、過(guò)氧化氫或其他過(guò)氧化物，清除逆境脅迫產(chǎn)生的活性氧，維持活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，是生物體內(nèi)清除活性氧的主要保護(hù)酶[27]。本研究通過(guò)測(cè)定種子萌發(fā)期3 種抗氧化酶活性指標(biāo)，分析不同水分脅迫對(duì)抗氧化酶活性的影響，結(jié)果顯示，不同水分脅迫處理下SOD、POD、CAT 酶的活性加強(qiáng)。這與Lotfi 等[28]研究干旱脅迫對(duì)不同基因型波斯核桃(Juglans regia)抗氧化酶活性的影響和秦立剛等[29]研究PEG 干旱脅迫下3 種蔥屬植物種子通過(guò)誘導(dǎo)SOD、POD、CAT 酶的活性，清除體內(nèi)活性氧的研究結(jié)果相似。此外，薛靜怡等[30]的研究表明在淹水處理下千金子(Leptochloa chinensis)種子的POD、SOD酶活性都隨著水分脅迫的加重而有不同程度的增高。Gomathi 等[31]的研究也表明SOD 在短期淹水脅迫下，在控制活性氧和保護(hù)細(xì)胞免受引起的膜損傷方面起著重要作用。這說(shuō)明，淹水或干旱脅迫都會(huì)使種子細(xì)胞組織中產(chǎn)生活性氧，抑制正常的生長(zhǎng)代謝。在本研究中淹水處理與10% PEG、15% PEG 處理間的SOD、POD、CAT 酶的活性無(wú)顯著差異，說(shuō)明在本研究處理時(shí)間內(nèi)，針對(duì)活性氧傷害方面，黑麥草淹水處理與干旱脅迫具有相似的應(yīng)答機(jī)制，植物細(xì)胞組織中氧化防御系統(tǒng)誘導(dǎo)抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性上升，清除活性氧對(duì)組織造成的傷害。

綜上所述，0 - 24 h 為黑麥草種子萌發(fā)的快速吸水時(shí)期，種子持續(xù)吸水36 h 以后，種子吸水量表現(xiàn)出停止增長(zhǎng)狀態(tài)，因此對(duì)種子浸種處理時(shí)間建議選擇24 - 36 h。PEG 抑制種子萌發(fā)的吸水量和吸水率，隨著PEG 濃度升高，種子萌發(fā)吸水量和吸水率降低。10% PEG 濃度處理下，黑麥草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與CK 無(wú)顯著性差異，但發(fā)芽指數(shù)和株高已經(jīng)受到顯著影響，表明10% PEG 濃度顯著影響種子的萌發(fā)。淹水處理下黑麥草種子萌發(fā)過(guò)程無(wú)氧呼吸代謝加強(qiáng)，淹水和15% PEG 干旱脅迫下α-淀粉酶活性降低，淀粉代謝量減少，淹水和10%、15% PEG干旱脅迫下種子發(fā)芽過(guò)程中抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性加強(qiáng)。本研究結(jié)果為黑麥草種子萌發(fā)過(guò)程的水分管理提供理論參考依據(jù)。