劉亞西，周 楊，李 楊，劉金平，王 丹

（西華師范大學生命科學學院 / 西南野生動植物資源保護省部共建教育部重點實驗室, 四川 南充 637009）

多年生黑麥草(Lolium perenne)為禾本科黑麥草屬草本植物，為典型的冷季型草坪草，兼具坪用和飼用價值，一直以來都是草坪建植和牧草栽培的優(yōu)良草種之一[1-2]。種子萌發(fā)作為植物生活史的第一個階段，種子的萌發(fā)易受到許多外界因素的影響，澇害、干旱、鹽堿地等都影響種子的萌發(fā)[3]。在其他環(huán)境條件適宜的情況下，種子萌發(fā)最容易受到水分的影響，水分過多或過少都會對種子的萌發(fā)造成影響[4-5]。

種子萌發(fā)是有序的生理過程，當萌發(fā)環(huán)境中水分含量過少時，細胞膜系統(tǒng)被破壞，內含物外滲，滲透調節(jié)物質及酶活性都受到影響，進而影響種子的萌發(fā)[6]。當萌發(fā)環(huán)境中水分含量過多時，同樣會抑制種子萌發(fā)過程中正常的代謝活動，種子淹水時間過長，缺少氧氣時進行無氧呼吸影響正常生長發(fā)育[7]。在淹水脅迫下，種子因缺氧進行無氧呼吸，使得種子中積累了大量的有害物質(如乙醇)，從而限制了種子的萌發(fā)[8]。種子的主要成分是淀粉，因此種子的萌發(fā)過程實際上主要是淀粉的分解過程。而淀粉的分解是由多種酶共同作用的結果[9]，其中α-淀粉酶作為主要的酶類參與淀粉的水解[10]。有研究表明，淀粉含量與種子的發(fā)芽特性指標呈極顯著負相關關系，而α-淀粉酶活性則剛好相反[11]。因此淀粉含量和α-淀粉酶活性能夠很好地反映種子的萌發(fā)情況。淹水和干旱脅迫會影響植物體內的抗氧化防御系統(tǒng)，維持活性氧代謝平衡、保護膜結構的功能，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)的含量發(fā)生改變[12]。

本研究對黑麥草種子進行不同程度的水分脅迫處理，分析其種子萌發(fā)的吸水特性以及受到的影響，探討淹水和干旱脅迫對黑麥草種子萌發(fā)、無氧呼吸、淀粉酶活性和抗氧化酶特性等方面的影響，對了解黑麥草種子萌發(fā)過程中水分代謝的規(guī)律以及水分合理利用和高效生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試多年生黑麥草品種為‘雅晴’(Yatsyn)，種子購自百綠國際草業(yè)有限公司(種子于2019 年生產，發(fā)芽率為90%，千粒重為1.752 5 g)。聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG-6000)為化學純，生產廠家為國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗處理

選取健康飽滿且大小一致的黑麥草種子，置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿內[10]進行發(fā)芽試驗，種子吸水試驗設置對照(CK，蒸餾水)、10% PEG (T1)、15% PEG(T2)、20% PEG (T3)、淹水(T4)共5 個水分處理，種子萌發(fā)試驗設置CK、T1、T2、T4共4 個水分處理(因預試驗中T3處理下種子發(fā)芽率僅為8%)，每個處理3 次重復，每個培養(yǎng)皿內放置50 粒種子。利用PEG-6000 溶液模擬干旱脅迫，溶液配制方法參考Michel和Kaufmann[13]，3 種PEG 濃度(10%、15%、20%)對應水勢分別為?0.2、?0.4 和?0.6 MPa[14]。淹水處理在每個培養(yǎng)皿內加入15 mL 蒸餾水使得種子剛好淹沒在水中，其余處理的培養(yǎng)皿內加入5 mL 相應處理液，每天定時以稱重法補充散失水分以維持培養(yǎng)皿內水勢的恒定。種子吸水和萌發(fā)試驗在恒溫光照培養(yǎng)箱中進行，光照/黑暗時間為12 h/12 h，溫度25 ℃，相對濕度為80%。每天在同一時間段統(tǒng)計發(fā)芽的種子數，以胚根伸長為種子長度的1/2 視為發(fā)芽。

1.3 測定指標與方法

1.3.1吸水指標測定

種子放入光照培養(yǎng)箱之前對每個培養(yǎng)皿內的種子稱重，即為種子的初始重量。放入培養(yǎng)箱之后前期每隔3 h 取出種子用濾紙吸干表面水分后稱重，12 h 后每隔6 h 取出種子稱重，直到48 h。根據公式計算種子的吸水量、吸水率和吸水速率。

吸水量 =Wt?Wo；

吸水率 = (Wt?Wo) /Wo× 100%。

式中：Wt為種子吸水后的重量，Wo為種子初始重量。吸水速率 = (Wt?Wt?1) /H。

式中：Wt?1為前一個階段種子質量，H為間隔時間。

1.3.2 種子萌發(fā)相關指標測定

于種子萌發(fā)吸水48 h 后測定乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)活性，種子萌發(fā)第3 天測定淀粉含量、α-淀粉酶活性。第5 天測定發(fā)芽勢，第12天統(tǒng)計發(fā)芽率，發(fā)芽試驗結束從每個培養(yǎng)皿中隨機選取10 株幼苗用直尺測量株高、根長。種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數具體計算方法如下：

發(fā) 芽 勢 = (第5 天 發(fā) 芽 種 子 數/供 試 種 子 數) ×100%；

發(fā)芽率 = (第12 天發(fā)芽種子數/供試種子數) ×100%； ∑

發(fā)芽指數(germination index,GI) = (Gt/Dt)。式中：Gt為在時間t內的發(fā)芽個數，Dt為相應的發(fā)芽天數[15]。

發(fā)芽結束后測定SOD、POD、CAT 酶活性，淀粉含量、α-淀粉酶活性、ADH、SOD、POD、CAT 酶活性均采用蘇州格銳思生物科技公司的試劑盒測定。

1.4 數據統(tǒng)計分析

采用Excel 2010 對數據進行處理和制圖，應用SPSS 22.0 軟件采用單因素方差分析方法(ANOVA)對各觀測指標平均值進行分析，利用DUNCAN 方法對各指標平均值進行差異顯著性分析(P＜ 0.05)。

2 結果與分析

2.1 黑麥草種子萌發(fā)吸水動態(tài)特性

不同水分脅迫下吸水量和吸水率變化趨勢基本一致，大致可分為3 個階段(圖1)。第1 階段是0～24 h；第2 階段是24 ～ 36 h；第3 階段是36 h 之后，種子吸水逐漸趨于飽和，48 h 時CK 處理部分種子開始萌發(fā)。對不同水分處理下黑麥草種子的最終吸水量和吸水率進行差異性分析顯示(表1)，T4和CK 處理下的吸水量和吸水率無顯著差異(P＞ 0.05)，但干旱與CK 處理間差異顯著 (P＜ 0.05)。隨著PEG濃度的增加，種子的吸水量和吸水率逐漸下降，20%PEG 脅迫處理時種子的吸水量和吸水率最低，與CK 相比降低了28.65%和29.34%，且與T1、T2處理間差異顯著(P＜ 0.05)。在不同水分處理下黑麥草種子的吸水速率在前3 h 達到最大值，之后逐漸下降并慢慢趨于穩(wěn)定。

表1 不同水分脅迫對黑麥草種子最終吸水量和吸水率的影響Table 1 Effects of different water stress treatments on final water quantity and water absorption by ryegrass seeds

圖1 不同水分脅迫對黑麥草種子萌發(fā)吸水特性的影響Figure 1 Effects of different water stress treatments on germination and water absorption characteristics of ryegrass seeds

2.2 不同水分脅迫處理對黑麥草種子萌發(fā)的影響

水分脅迫對種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率有顯著影響(P＜ 0.05) (表2)。發(fā)芽勢和發(fā)芽率隨著PEG 濃度的增加而降低，10% PEG 處理與CK 之間無顯著差異(P＞ 0.05)，15% PEG 處理的發(fā)芽勢和發(fā)芽率比CK 分別降低了25.27%和24.21%。淹水處理下種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均與CK 存在顯著差異(P＜ 0.05)，但都與15% PEG 處理無顯著差異(P＞ 0.05)。干旱和淹水都顯著影響種子的發(fā)芽指數，隨著干旱程度的增加發(fā)芽指數越小，但T2和T4處理間無顯著差異(P＞ 0.05)。干旱抑制了黑麥草幼苗的生長，10%PEG、15% PEG 與CK 相比差異顯著，分別降低了24.49%和37.75%；T4處理下株高與CK 相比顯著降低(P＜ 0.05)，但與T1處理間無顯著差異(P＞ 0.05)。根長隨著PEG 濃度的增加表現為先減小后上升的趨勢，T1處理下的根長略低于對照且無顯著差異(P＞ 0.05)，T2處理比CK 提高了39.89%。

表2 不同水分脅迫對黑麥草種子萌發(fā)指標的影響Table 2 Effects of different water stress treatments on germination indexes of ryegrass seeds

2.3 不同水分脅迫處理對黑麥草種子萌發(fā)過程中乙醇脫氫酶活性的影響

種子吸水48 h 后，各脅迫處理間的乙醇脫氫酶(ADH)活性表現不同的變化趨勢(圖2)。T4處理顯著提高了乙醇脫氫酶活性(P＜ 0.05)，與對照相比增加了50.62%，而T1、T2和CK 處理之間無顯著性差異(P＞ 0.05)。T4與T1、T2處理相比，ADH 活性顯著提高了50.15%、43.03% (P＜ 0.05)。淹水脅迫(T4)處理，ADH 酶活性大于CK 處理，表明種子處于淹水中缺氧逆境條件下，為了維持短期的生活機能，將會進行無氧呼吸，使ADH 酶活性增強。

圖2 不同水分脅迫對黑麥草種子乙醇脫氫酶活性的影響Figure 2 Effects of different water stress treatments on alcohol dehydrogenase activity in ryegrass seeds

2.4 不同水分脅迫處理對黑麥草種子萌發(fā)淀粉含量和α-淀粉酶活性的影響

CK 處理的黑麥草種子的α-淀粉酶活性最高，干旱和淹水處理下α-淀粉酶活性表現出下降的趨勢(圖3)，T1處理下與CK 相比沒有顯著差異(P＞0.05)，T2和T4處理與CK 相比α-淀粉酶活性顯著降低(P＜ 0.05)，分別降低了73.19%和78.01%。與CK 相比，T1處理下淀粉含量增加，但二者無顯著差異(P＞ 0.05)，T2和T4處理下淀粉含量都顯著高于CK (P＜ 0.05)，分別高于對照38.77%和39.90%。表明15% PEG 干旱處理(T2)和淹水脅迫(T4)都抑制了種子萌發(fā)過程中淀粉酶的活性，進一步影響種子的萌發(fā)過程中淀粉的代謝。

圖3 不同水分脅迫對黑麥草種子α-淀粉酶活性和淀粉含量的影響Figure 3 Effects of different water stress treatments on α-amylase activity and starch content in ryegrass seeds

2.5 不同水分脅迫處理對黑麥草種子萌發(fā)抗氧化酶活性的影響

與CK 相比不同水分脅迫處理下，3 種抗氧化酶活性均表現出顯著增高的相同變化趨勢(P＜ 0.05)(圖4)。與CK 相比，T1、T2和T4處理均顯著促進了SOD 酶活性(P＜ 0.05)，分別增加了54.96%、57.24%和59.50%。與CK 相比，T1、T2和T4處理均顯著促進了POD 酶活性(P＜ 0.05)，分別增加了40.16%、41.54%和47.59%。與CK 相比，T1、T2和T4處理均顯著促進 了CAT 酶 活 性(P＜ 0.05)，分 別 增 加 了52.63%、54.58%和55.29%。在本研究處理的時間點內，T1、T2、T4處理之間3 種抗氧化酶活性均無顯著差異(P＞0.05)。表明PEG 干旱處理(T1、T2)和淹水脅迫(T4)均顯著影響了種子萌發(fā)正常的生理代謝，植物通過抗氧化酶系統(tǒng)適應脅迫環(huán)境。

圖4 不同水分脅迫對黑麥草種子抗氧化酶活性的影響Figure 4 Effects of different water stress treatments on antioxidant enzyme activities of ryegrass seeds

3 討論與結論

在黑麥草種子萌發(fā)吸水動態(tài)試驗中，不同水分脅迫下各組吸水量和吸水率動態(tài)變化趨勢基本相同，吸水量和吸水率逐漸增加，36 h 后種子的吸水量和吸水率逐漸趨于穩(wěn)定。PEG 能使植物處于類似于干旱的環(huán)境中，可用來模擬干旱脅迫[16]。本研究中隨著PEG 濃度的增高和干旱脅迫程度的增加，吸水量和吸水率降低。在CK 處理下，48 h 黑麥草種子的吸水量占種子干重的66.72%，吸水率達到1.34%時種子開始萌發(fā)，而不同PEG 脅迫下的黑麥草種子萌發(fā)時間延遲。說明干旱是通過抑制黑麥草種子的吸水量和吸水率從而影響種子的萌發(fā)。有研究表明，對種子萌發(fā)吸水量的測定可為種子浸種時間的確定提供一定的依據[17]。短期的淹水脅迫對種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢不會產生很大影響，但長期淹水脅迫會降低種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢[18]。干旱在生產中可導致延遲或不均勻的種子萌發(fā)，本研究中干旱脅迫抑制黑麥草種子萌發(fā)，隨著干旱脅迫的增加，黑麥草種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數都顯著降低。

植物應對水分脅迫通過多種途徑，包括調節(jié)其結構、能量代謝、光合作用、呼吸作用和內源激素的變化等[19]。種子萌發(fā)過程中，完成吸脹吸水后，代謝相關酶活化，呼吸作用為萌發(fā)過程的各種代謝活動提供能量。種子在環(huán)境缺氧條件下，進行無氧呼吸，ADH 酶活性增加。長期進行無氧呼吸，使細胞內乙醛、乙醇和乳酸含量大量積累，ATP 合成減少，養(yǎng)分吸收下降，會對植物細胞造成傷害，使植物生長受到抑制。 Brownstein 等[20]研究了淹水與厭氧代謝相關的酶的關系，結果表明在淹水處理下鹽堿草甸物種都表現出顯著增加的ADH 活性。這與本研究結果一致，在淹水處理下ADH 活性顯著高于PEG和CK 處理，而PEG 和CK 處理間ADH 活性無顯著差異。有些植物的種子在淹水環(huán)境中萌發(fā)效果較好，如水稻(Oryza sativa)、蘆葦(Phragmites australis)等，在缺氧環(huán)境中，ADH 代謝在種子萌發(fā)和植物存活中起著至關重要的作用[21]。本研究中淹水處理下ADH 酶活性升高，表明淹水處理干擾了種子正常的呼吸代謝作用，誘導無氧呼吸的產生，影響正常的代謝，使植株生長顯著低于CK 處理。

種子的萌發(fā)過程需要將種子貯藏物淀粉和蛋白質通過酶轉化為生長發(fā)育所需要的糖類，例如淀粉的分解代謝[22]。本研究中淹水或干旱處理淀粉的含量都顯著高于CK，α-淀粉酶活性顯著低于CK。這與在干旱脅迫下，PEG 脅迫顯著抑制了黃瓜(Cucumis sativus)種子[23]和莧菜(Amaranthus tricolor)種子[24]的α-淀粉酶活性，使得種子具有較高的淀粉含量的研究結果一致。稻谷可以在淹水條件下發(fā)芽，而大多數其他谷類則沒有類似的表現，在淹水的情況下，由于α-淀粉酶的成功產生，稻谷降解淀粉的能力可能是使水稻在厭氧條件下發(fā)芽的因素之一[25]。本研究中淹水處理和干旱處理間α-淀粉酶活性無顯著性差異，同時顯著低于CK，說明黑麥草淹水和干旱脅迫處理都表現為顯著抑制α-淀粉酶活性，降低淀粉的代謝速率，使得種子中具有較高的淀粉含量，影響種子的能量轉化，進一步影響種子萌發(fā)。

水分脅迫使植物細胞內產生活性氧，干擾正常的生命代謝活動[26]。但植物對逆境的響應會產生自我保護的抗氧化酶，SOD、POD、CAT 分別通過催化超氧化物、過氧化氫或其他過氧化物，清除逆境脅迫產生的活性氧，維持活性氧的動態(tài)平衡，是生物體內清除活性氧的主要保護酶[27]。本研究通過測定種子萌發(fā)期3 種抗氧化酶活性指標，分析不同水分脅迫對抗氧化酶活性的影響，結果顯示，不同水分脅迫處理下SOD、POD、CAT 酶的活性加強。這與Lotfi 等[28]研究干旱脅迫對不同基因型波斯核桃(Juglans regia)抗氧化酶活性的影響和秦立剛等[29]研究PEG 干旱脅迫下3 種蔥屬植物種子通過誘導SOD、POD、CAT 酶的活性，清除體內活性氧的研究結果相似。此外，薛靜怡等[30]的研究表明在淹水處理下千金子(Leptochloa chinensis)種子的POD、SOD酶活性都隨著水分脅迫的加重而有不同程度的增高。Gomathi 等[31]的研究也表明SOD 在短期淹水脅迫下，在控制活性氧和保護細胞免受引起的膜損傷方面起著重要作用。這說明，淹水或干旱脅迫都會使種子細胞組織中產生活性氧，抑制正常的生長代謝。在本研究中淹水處理與10% PEG、15% PEG 處理間的SOD、POD、CAT 酶的活性無顯著差異，說明在本研究處理時間內，針對活性氧傷害方面，黑麥草淹水處理與干旱脅迫具有相似的應答機制，植物細胞組織中氧化防御系統(tǒng)誘導抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性上升，清除活性氧對組織造成的傷害。

綜上所述，0 - 24 h 為黑麥草種子萌發(fā)的快速吸水時期，種子持續(xù)吸水36 h 以后，種子吸水量表現出停止增長狀態(tài)，因此對種子浸種處理時間建議選擇24 - 36 h。PEG 抑制種子萌發(fā)的吸水量和吸水率，隨著PEG 濃度升高，種子萌發(fā)吸水量和吸水率降低。10% PEG 濃度處理下，黑麥草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢與CK 無顯著性差異，但發(fā)芽指數和株高已經受到顯著影響，表明10% PEG 濃度顯著影響種子的萌發(fā)。淹水處理下黑麥草種子萌發(fā)過程無氧呼吸代謝加強，淹水和15% PEG 干旱脅迫下α-淀粉酶活性降低，淀粉代謝量減少，淹水和10%、15% PEG干旱脅迫下種子發(fā)芽過程中抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性加強。本研究結果為黑麥草種子萌發(fā)過程的水分管理提供理論參考依據。