吳昱果，周 強，賈程琳，劉志鵬

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 /

蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州 730020）

自然界中，同一屬內(nèi)的牧草種子，甚至不同屬間的種子，在顏色、形狀、大小和重量上有很多相似之處，但每種牧草都有自己獨特的生命周期和農(nóng)業(yè)用途，因此高純度的牧草種子是品質(zhì)和產(chǎn)量的重要保障[1-2]。然而，由于遺傳特性和生長環(huán)境(氣候和土壤等)的影響，一些植物種子在大小、形狀和顏色上都具有相似性[3-4]。因此，當(dāng)這些相似的種子混合在一起時，很難區(qū)分開來。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是多年生豆科草本植物，具有營養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高和適口性好等特點，作為首選飼料作物，在全球范圍廣泛種植[5-6]。近年來，隨著我國苜蓿種植面積的逐步擴大，苜蓿雜草問題已成為制約苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一[7-8]。紫花苜蓿種子中?；煊熊俎］私z子(Cuscuta approximata)種子，有研究表明在我國新疆塔城地區(qū)，紫花苜蓿種子中菟絲子種子的含量高達13.4%，菟絲子種子已嚴(yán)重危害紫花苜蓿的種子生產(chǎn)[9]。由于菟絲子種子和紫花苜蓿種子在形態(tài)上較為相似、種子細(xì)小[7]，一旦紫花苜蓿中混有苜蓿菟絲子種子，難以鑒定和清除，給紫花苜蓿的生產(chǎn)帶來重大損失，并對當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)造成不可逆的惡性破壞[9]。此外，由于菟絲子屬植物惡性寄生的生物特性，我國海關(guān)已將菟絲子列為檢疫性雜草，但從進口紫花苜蓿種子中快速鑒別是否混入菟絲子種子仍較為困難[10]。因此，亟需一種準(zhǔn)確、快速、低成本的鑒定方法來區(qū)分紫花苜蓿種子和菟絲子種子。

截至目前，相似種子常用的鑒定方法是形態(tài)比較[11-12]、簡單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeat,SSR)分子標(biāo)記[13]和多光譜影像[14]，但形態(tài)比較法需要經(jīng)驗豐富的鑒定人員重復(fù)觀察，耗時長且不可靠；SSR 分子標(biāo)記法雖然準(zhǔn)確，但試驗設(shè)計復(fù)雜；多光譜影像法則需要特定的多光譜成像系統(tǒng)。因此，本研究利用分子實驗室常用的儀器和操作技術(shù)，對8 份紫花苜蓿種質(zhì)和3 份不同來源的苜蓿菟絲子種子進行鑒定；根據(jù)菟絲子和紫花苜蓿rbcL基因的序列差異，針對菟絲子設(shè)計特有引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，以期開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的分子方法。為牧草種子生產(chǎn)和海關(guān)檢疫提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

如表1 所列，本研究通過8 份紫花苜蓿種質(zhì)和3 份不同來源的苜蓿菟絲子，每份材料隨機挑選20 粒種子，進行后續(xù)種子DNA 提取。

表1 紫花苜蓿和苜蓿菟絲子種質(zhì)資源信息Table 1 Germplasm accessions of Medicago sativa and Cuscuta approximata used in this study

1.2 試驗方法

1.2.1 種子形態(tài)特征測定

每個種質(zhì)中隨機選擇15 粒種子，利用體式顯微鏡(Leica, M205)觀察紫花苜蓿種子和苜蓿菟絲子種子的形態(tài)。通過Digimizer 軟件(MedCalc Software,Belgium)測定種子長度、寬度、周長和面積4 個形態(tài)學(xué)指標(biāo)，進行形態(tài)學(xué)比較[15]。

1.2.2 種子DNA 提取

分別從8 個紫花苜蓿種質(zhì)和3 個不同來源苜蓿菟絲子中隨機選取20 粒種子，通過CTAB 法進行基因組DNA 的提取[16]。苜蓿菟絲子和紫花苜蓿種子的DNA 按照1 ∶ 1、1 ∶ 5、1 ∶ 25、1 ∶ 100、1 ∶ 500 和1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000、1 ∶ 5 000、1 ∶ 10 000 的比例混合后，備用。此外，將苜蓿菟絲子和紫花苜蓿種子粒數(shù)分別按照1 ∶ 1、1 ∶ 5、1 ∶ 25、1 ∶ 100、1 ∶ 500 和1 ∶ 1 000 的比例混合，研磨后，進行DNA 提取和PCR 擴增。

1.2.3 引物設(shè)計

根據(jù)苜蓿菟絲子和紫花苜蓿rbcL基因的序列差異，針對苜蓿菟絲子設(shè)計特異性引物(圖1)。rbcL基因是植物葉綠體基因組中相對保守的基因，已成功用于種間和屬內(nèi)種間系統(tǒng)關(guān)系的研究[17-18]，擴增產(chǎn)物穩(wěn)定，提高鑒定結(jié)果的可靠性。該引物的序列為Cuscuta-F，5′-CGAAGATCTTCGAATACCTCCA-3′；Cuscuta-R，5′-ATCAATAACTGCATGCATTGCG-3′。

圖1 紫花苜蓿和苜蓿菟絲子葉綠體DNA 部分rbcL 基因區(qū)域的序列比對Figure 1 Sequence alignments of a portion of the rbcL regions of alfalfa and dodder chloroplast DNA

1.2.4 PCR 擴增

利用苜蓿菟絲子的特異引物，對上述種子基因組DNA 進行PCR 檢測。PCR 檢測體系的總體積為10 μL，其中包括2 × EcoTaq PCR SuperMix (上海 生 工，產(chǎn) 品 編 號：SK2082) 5 μL，引 物Cuscuta-F 和引物Cuscuta-R 各0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，以及上述種子DNA 模板(50 ng·μL-1) 0.5 μL。擴增條件為：

1) 94 ℃預(yù)變性3 min；2) 94 ℃變性30 s；3) 57 ℃退火30 s；4) 72 ℃延 伸50 s；5)第2 至第4 步 驟循環(huán)33 次；6) 72 ℃ 延伸7 min。而且，苜蓿菟絲子種子和 紫 花 苜 蓿 種 子DNA 分 別 以1 ∶ 1、1 ∶ 5、1 ∶ 25、1 ∶ 100、1 ∶ 500、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000、1 ∶ 5 000、1 ∶ 10 000的比例混合，通過混合后的種子基因組DNA 用作模 板 進 行PCR 擴 增。由 于 以1 ∶ 5000 和1 ∶ 10 000比例混合的DNA 為模板時，擴增苜蓿菟絲子的PCR 產(chǎn)物較少，難以檢測到。因此將此次PCR 產(chǎn)物作為混合比例的DNA 模板繼續(xù)進行二次PCR擴增。

1.2.5 電泳檢測

取5 μL PCR 產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳電壓為135 V，時間為25 min。電泳完成后，用凝膠成像儀照相記錄分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)特征和菟絲子危害

通過體式顯微鏡和Digimizer 的軟件測量，結(jié)果表明紫花苜蓿種子和苜蓿菟絲子種子均細(xì)小，在形態(tài)上較為相似，如兩個物種的種子面積都在1.0 ～2.0 mm2(圖2、表2)，通過肉眼難以辨認(rèn)，進一步增加了植物檢疫工作的難度。在生產(chǎn)中，若沒有及時發(fā)現(xiàn)和清除混在紫花苜蓿中的菟絲子種子，將給紫花苜蓿產(chǎn)量帶來重大損失，并對當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)造成不可逆的惡性破壞(圖3)。

圖2 紫花苜蓿和苜蓿菟絲子種子Figure 2 Seeds of Medicago sativa and Cuscuta approximata

圖3 寄生在紫花苜蓿上的菟絲子Figure 3 Cuscuta approximata twining around Medicago sativa

表2 8 份紫花苜蓿種質(zhì)和3 份不同產(chǎn)地苜蓿菟絲子的4 項種子形態(tài)指標(biāo)Table 2 Statistical analyses of four morphological indices between the seeds of eight Medicago sativa accessions and Cuscuta approximata from different habitats

2.2 苜蓿菟絲子和紫花苜蓿種子的電泳結(jié)果

根據(jù)PCR 產(chǎn)物的電泳圖譜，8 份紫花苜蓿種子和3 份苜蓿菟絲子種子材料之間的電泳結(jié)果差異明顯。針對Cuscuta-F 和Cuscuta-R 引物，紫花苜蓿的DNA 樣品無擴增條帶，苜蓿菟絲子的DNA 樣品在約為500 bp 的位置擴增出條帶(圖4)。

圖4 苜蓿菟絲子和紫花苜蓿種質(zhì)間的電泳結(jié)果Figure 4 The electrophoresis results obtained for dodder and alfalfa accessions

2.3 苜蓿菟絲子和紫花苜蓿種子混合的電泳結(jié)果

此外，還通過按預(yù)定比例混合苜蓿菟絲子和紫花苜蓿種子的DNA，進一步證明該引物對的靈敏性和準(zhǔn)確性(圖5)。在苜蓿菟絲子和紫花苜蓿的DNA比例為1 ∶ 1、1 ∶ 5、1 ∶ 25、1 ∶ 100、1 ∶ 500、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000 的 水 平 下，用Cuscuta-F 和Cuscuta-R 引 物均能擴增出大小約為500 bp 的條帶，且隨著菟絲子DNA 濃度的降低，條帶亮度也逐漸減弱。在苜蓿菟絲子和紫花苜蓿的DNA 濃度為1 ∶ 5 000 和1 ∶ 10 000的水平下，初次PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，無條帶；但將1 μL 初次PCR 產(chǎn)物作為DNA 模板，再經(jīng)過擴增后有明亮的條帶出現(xiàn)，且條帶大小和之前的結(jié)果一致。

圖5 苜蓿菟絲子種子和紫花苜蓿種子不同比例DNA 混合物的電泳結(jié)果Figure 5 The electrophoresis results obtained for mixtures of dodder and alfalfa seed DNA

同時，為進一步驗證該方法的可行性，將苜蓿菟絲子和紫花苜蓿按照一定粒數(shù)的種子比例混合(圖6)。在苜蓿菟絲子和紫花苜蓿種子粒數(shù)的比例分別為1 ∶ 1、1 ∶ 5、1 ∶ 25、1 ∶ 100、1 ∶ 500 和1 ∶ 1 000的水平下，均可以準(zhǔn)確檢測到混在紫花苜蓿種子中的菟絲子種子。

圖6 苜蓿菟絲子和紫花苜蓿不同比例種子粒數(shù)混合的電泳結(jié)果Figure 6 The electrophoresis results obtained for different numbers of dodder seeds mixed with alfalfa seeds

2.4 鑒定形態(tài)相似種子的通用方法

以苜蓿菟絲子和紫花苜蓿種子鑒定方法為基礎(chǔ)，初步繪制了形態(tài)相似種子鑒定的通用流程圖(圖7)。首先，在NCBI 上查找相似物種同源基因的序列，根據(jù)同源基因的序列差異，設(shè)計物種的特異性引物；隨后，進行種子DNA 的提取、PCR、瓊脂糖凝膠電泳和照相分析；最終，根據(jù)電泳條帶的有無，分析結(jié)果，完成鑒定。整個流程大約可在5 h 內(nèi)完成?？傊摲椒ㄖ恍柰ㄟ^5 個關(guān)鍵步驟(序列查找、引物設(shè)計、DNA 提取、PCR、凝膠電泳)可快速、準(zhǔn)確、靈敏地用于形態(tài)相似種子的鑒定。

圖7 鑒定種子形態(tài)相似牧草的總結(jié)流程圖Figure 7 A summary flowchart for the discrimination of forage seeds with similar morphologies

3 討論與結(jié)論

高品質(zhì)種子是優(yōu)質(zhì)牧草的重要保障，但隨著我國進口紫花苜蓿種子數(shù)量的增加[19-20]，寄生紫花苜蓿的菟絲子傳入我國的風(fēng)險越來越大。一旦紫花苜蓿種子中混有菟絲子種子，傳統(tǒng)方法難以鑒定，將給紫花苜蓿的生產(chǎn)帶來不可挽回的損失。我國現(xiàn)行的《牧草種子檢驗規(guī)程》[21]中常用的測定方法主要有4 種，分別是種子測定、幼苗測定、溫室或培養(yǎng)室的植株測定和田間小區(qū)植株測定。其中，苜蓿屬(Medicago)的種子測定是根據(jù)其形態(tài)特征；幼苗測定是對幼苗進行形態(tài)和化學(xué)鑒定，如將切開的根尖或其他細(xì)胞在顯微鏡下進行測定；溫室或培養(yǎng)室的植株測定是當(dāng)植株達到適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段時，觀察記載每個植株的目標(biāo)測定性狀；田間小區(qū)植株測定是記錄和觀察不同植株全生育期的差異，鑒定工作需延續(xù)到整個生育期。因此，建立一種快速、可靠性高、靈敏度高、通用的分子方法用于區(qū)分形態(tài)相似的牧草種子鑒定，對種子生產(chǎn)和畜牧業(yè)具有重要意義。

由于植物的葉綠體DNA 為母性遺傳，相對于核基因更保守，因此已被廣泛用于分子鑒定、植物條形碼分析和植物分子系統(tǒng)進化分析[22-24]。本研究通過比較苜蓿菟絲子和紫花苜蓿葉綠體rbcL基因的序列差異，設(shè)計苜蓿菟絲子的特異引物Cuscuta-F和Cuscuta-R，依次進行DNA 提取、PCR 擴增和電泳，最終根據(jù)擴增條帶的有無，快速、準(zhǔn)確地鑒定紫花苜蓿種子中是否混有雜草菟絲子種子，整個過程只需要5 h 左右。

雖然本研究中苜蓿菟絲子和紫花苜蓿種子DNA 比例極低(如1 ∶ 10 000)，仍可通過二次PCR擴增檢測到菟絲子種子，即使1 000 粒紫花苜蓿種子中混有1 粒苜蓿菟絲子，也可以準(zhǔn)確檢測出混雜在紫花苜蓿中的苜蓿菟絲子。因此，該方法可為海關(guān)檢疫紫花苜蓿種子中是否攜帶寄生植物菟絲子種子提供便捷的檢測技術(shù)，大大提高檢疫部門對菟絲子檢疫的工作效率。然而，該通用方法也存在一些局限性，一些草類植物在NCBI 中尚未有公布的序列，因此無法設(shè)計引物。這種情況需要利用傳統(tǒng)的鑒定方法，如觀察種子形態(tài)，以及隨機抽樣進行種植，在植物幼苗和成熟期進行比較驗證。

總之，與現(xiàn)有的其他鑒定方法相比，如傳統(tǒng)的形態(tài)比較，SSR 分子標(biāo)記和多光譜影像，鑒定方法費時、耗力或需要特定的多光譜成像系統(tǒng)。本研究建立的通用方法具有明顯優(yōu)勢，該方法的高準(zhǔn)確性，簡便性，可靠性和靈敏性也增加了其在野生牧草種質(zhì)資源的搜集和育種，以及牧草種子純度的鑒定和評估等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。