楊曉蕾，李建宏，姚 拓，趙桂琴，竇嘉寧，魏愷全

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 / 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730070）

鐮刀菌(Fusariumspp.)屬于叢梗孢目瘤痤孢科鐮刀菌屬的有性型真菌。鐮刀菌對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品具有很強(qiáng)的破壞性，破壞植物體結(jié)構(gòu)，分泌次生代謝物，使植株出現(xiàn)枯萎、穗腐和腐爛等現(xiàn)象[1]，病害常發(fā)生于農(nóng)田種植區(qū)，常見病害有棉花枯萎病、香蕉枯萎病等。木賊鐮刀菌作為根腐病的重要病原菌之一，在植物全生育期均可引起植株發(fā)病，苜蓿(Medicago sativa)根腐病的發(fā)生率最高達(dá)92%，造成苜蓿植株死亡率約60%，進(jìn)而縮短苜蓿利用年限，降低牧草品質(zhì)，致使苜蓿喪失其加工價(jià)值，降低苜蓿有效利用率[2-4]。根腐病在燕麥(Avena sativa)種植過(guò)程中時(shí)有發(fā)生，是一種常見的土傳病害，病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，植株根部腐爛，從而導(dǎo)致植株吸收水分與養(yǎng)分的能力減弱，導(dǎo)致植株地上部分出現(xiàn)葉片發(fā)黃、萎蔫等癥狀，病害嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整株死亡[5]。

目前對(duì)于鐮刀菌的防治，主要是采用化學(xué)農(nóng)藥的方法，化學(xué)農(nóng)藥雖能起到抑菌防病的作用，但其易造成農(nóng)藥殘留，引起土壤退化，影響農(nóng)產(chǎn)品安全，對(duì)人畜健康造成危害。利用生物防治已成為農(nóng)業(yè)病害防治的一種重要方法[6]，而生防菌更是一種重要的資源微生物。李巧玲等[7]以尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)為指示菌，自健康木香(Radix aucklandiae)植株根際土壤分離得到了2 株拮抗效果好且具有較好穩(wěn)定性的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis) at-21和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) at-97，抑菌率分別為66.8%和78.6%。在揚(yáng)花期被禾谷鐮刀菌侵染的麥穗上分離得到28 株芽孢桿菌，利用平板對(duì)峙法對(duì)其進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，其中20 株菌對(duì)禾谷鐮刀菌表現(xiàn)出明顯的拮抗作用；菌株JS62N、JS15E 和JS29I 能夠?qū)⒊嗝共“l(fā)病率降低80%多；所有菌株均能極顯著增加小麥(Triticum aestivum)的百粒重，菌株JS12Q效果最好，增加了101.4%[8]。目前對(duì)于木賊鐮刀菌生防菌資源的篩選及其特性研究報(bào)道較少，而燕麥根腐病近幾年也常有發(fā)生，嚴(yán)重影響飼用作物品質(zhì)及產(chǎn)量，基于此，本研究以燕麥植株為原材料，從其根際分離篩選出對(duì)木賊鐮刀菌有較好抑制作用的生防菌資源，并對(duì)其促生特性進(jìn)行研究，利用16S rRNA確定菌株分類學(xué)地位，以期為開發(fā)微生物制劑和生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究樣品為2020 年采集于甘肅省定西市臨洮縣(103°29′08″～104°19′34″E，35°03′42″～35°56′46″N)的一株燕麥植株，選取燕麥無(wú)病蟲害以及長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，將其連帶根際土壤進(jìn)行完整采挖，低溫(4 ℃)保存運(yùn)輸，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行根際微生物的分離篩選。

供試病原菌：木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化鈉0.2%，蒸餾水 1 L，pH 7.0 [9] (固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉 2%)。

無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖1%，磷酸三鈣0.5%，六水氯化鎂 0.5%，七水硫酸鎂 0.025%，氯化鉀 0.02%，硫酸銨 0.01%，蒸餾水1 L，pH 7.0[10]。

有機(jī)磷培養(yǎng)基：四水硫酸錳 0.003%，七水硫酸亞鐵 0.003%，碳酸鈣0.5%，葡萄糖1%， 硫酸銨0.05%，卵磷脂 0.02%，氯化鈉 0.03%，氯化鉀 0.03%，酵母粉0.4 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0[11]。

固氮NFM 培養(yǎng)基：氯化鈣0.002%，七水硫酸鎂0.02%，磷酸氫二鉀 0.05%，鉬酸鈉 0.0002%，氯化鈉0.01%，蘋果酸0.5%，氫氧化鉀0.45%，0.5% 溴百里酚藍(lán)5 mL，蒸餾水1 L，pH 7.0 [12] (半固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉0.2%)。

King 培養(yǎng)基：蛋白胨2%，磷酸氫二鉀0.115%，七水硫酸鎂0.15%，丙三醇15 mL，蒸餾水1 L，pH 7.0[13]。

1.3 拮抗細(xì)菌分離

將根際分為根表土壤、根系面和根內(nèi)3 個(gè)區(qū)域進(jìn)行菌株分離。稱取5 g 樣品，溶于45 mL 生理鹽水的三角瓶中，在搖床上充分震蕩30 min，制成懸浮液，靜置后在無(wú)菌條件下取1 mL 上清液逐級(jí)稀釋，依次獲得各質(zhì)量濃度梯度的菌懸液。分別取10?3、10?4、10?5濃度的土壤懸浮液50 μL 涂布于選擇培養(yǎng)基(NFM 培養(yǎng)基)平板上，每個(gè)濃度梯度3 個(gè)重復(fù)，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h。分離純化細(xì)菌3～5 次，將純化后的菌株用甘油保存法?80 ℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.4 拮抗細(xì)菌初篩

拮抗菌的初步篩選采用平板對(duì)峙法，將活化后的木賊鐮刀菌和待測(cè)拮抗菌共同接種于培養(yǎng)基表面，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，測(cè)量對(duì)照病原菌菌落直徑、抑菌圈直徑等指標(biāo)，并計(jì)算拮抗菌的抑菌率[15-16]。

式中：D為對(duì)照菌落直徑，d為處理菌落直徑。

1.5 拮抗細(xì)菌復(fù)篩

對(duì)初步篩選得到的菌株進(jìn)一步復(fù)篩，挑選抑菌圈直徑大、抑制效果持久的菌株進(jìn)行促生特性研究。

1.5.1 菌株的溶磷特性研究

在無(wú)菌條件下，分別將菌株單菌落接種至盛有30 mL 溶磷液體培養(yǎng)基的50 mL 三角瓶中，28 ℃、180 r·min?1條件下振蕩培養(yǎng)7 d，采用鉬 藍(lán)比色法(molybdenum blues colorimetry，MBC)測(cè)定溶磷量[10]。

1.5.2 菌株的固氮特性

采用乙炔還原法對(duì)菌株進(jìn)行定量測(cè)定[17]。用100 μL 平口微量進(jìn)樣器從血清瓶中分別抽取混合氣體100 μL 快速注入到氣相色譜儀氣體進(jìn)樣柱內(nèi)，記錄并觀察乙烯出峰時(shí)間及峰面積百分比，計(jì)算菌株固氮酶活性。

1.5.3 菌株分泌吲哚乙酸特性

挑取菌株單菌落接種于盛有已滅菌的30 mL King 液體培養(yǎng)基的50 mL 三角瓶中，在 28 ℃、180 r·min?1條 件 下 振 蕩 培 養(yǎng)7 d。采 用Salkowski 比 色法，測(cè)定菌株吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)特性[18-19]。

1.6 菌株分類地位確定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(OMEGA)，參考試劑盒說(shuō)明書提取菌株總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、核酸濃度測(cè)定儀確定樣品條帶的分布情況和DNA 純度。選取27F-1492R 作為通用引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)[20]。擴(kuò)增產(chǎn)物委托蘭州天啟基因生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將16S rDNA 序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，并使用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，SPSS 25.0 進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan 進(jìn)行多重比較(P＜ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良拮抗菌篩選

通過(guò)平板對(duì)峙法從燕麥根際共分離出木賊鐮刀菌拮抗菌株47 株，具有促生能力的菌株有26 株，其中有固氮酶活性的菌株15 株，溶無(wú)機(jī)磷菌株13 株，解有機(jī)磷菌株9 株。促生菌在木賊根際分布呈現(xiàn)根際效應(yīng)。

通過(guò)對(duì)菌株拮抗特性進(jìn)行復(fù)篩，本研究篩選的菌株中有6 株具有不同程度的拮抗木賊鐮刀菌的能力，抑制率均大于40%。DRT-17 菌株和DRT-18 菌株與其他拮抗菌相比，抑菌能力突出，抑菌率為89.40%和91.16%，顯著大于其他菌株(P＜ 0.05) (表1)。

表1 拮抗菌對(duì)對(duì)木賊鐮刀菌的拮抗作用Table 1 Inhibition rate of antagonistic strains against Fusarium oxysporum

2.2 菌株的促生特性

2.2.1 菌株溶磷特性

利用鉬銻抗比色法對(duì)篩選出的6 株拮抗菌株的溶磷能力測(cè)定(圖1)發(fā)現(xiàn)，菌株溶解無(wú)機(jī)磷的能力高于溶解有機(jī)磷的能力。各菌株均具有溶解無(wú)機(jī)磷的能力，溶磷量46.14～135.47 μg·mL?1，菌株中只有菌株DRT-3、菌株DRT-11、菌株DRT-17 具有溶解有機(jī)磷的能力，溶磷量分別為21.64 、31.65 和28.64 μg·mL?1。

圖1 生防菌株溶磷能力Figure 1 Capacity of biocontrol strains to dissolve phosphorus

2.2.2 菌株固氮能力

利用選擇性培養(yǎng)基NFM 分離出固氮菌株，乳白色菌落為主，菌落形狀呈規(guī)則圓形且菌落邊緣光滑。進(jìn)一步利用乙炔還原法對(duì)其固氮酶活性測(cè)定(圖2)發(fā)現(xiàn)，除菌株DRT-17 無(wú)固氮酶活性，5 株菌株固氮酶活性在51.82～210.81 nmol·(h·mL)?1(C2H4)，其中DRT-11 固氮酶活性最高。

圖2 生防菌株固氮能力Figure 2 Nitrogenase activity of biocontrol strains

2.2.3 菌株分泌生長(zhǎng)激素(IAA)的能力

測(cè)定菌株分泌IAA 的能力發(fā)現(xiàn)(表2)，各菌株均有顯色反應(yīng)，分泌量41.74～157.28 μg·mL?1，其中以菌株DRT-17 分泌生長(zhǎng)激素的能力最大，為157.28 μg·mL?1，菌株DRT-18 分泌植物生長(zhǎng)激素的能力最小，為41.74 μg·mL?1。

表2 生防菌株分泌IAA 的量Table 2 IAA secreting ability of biocontrol strains

2.3 菌株分類地位確定

綜合評(píng)價(jià)各菌株促生特性，通過(guò)對(duì)供試菌株DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，并測(cè)序獲得的序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析(圖3)，結(jié)果表明，6 株供試菌株中，菌株DRT-2、DRT-8 為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，DRT-3 為蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)，DRT-11 為不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.)，菌株DRT-17、DRT-18 為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，并構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖3 菌株 16SrDNA 基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA gene sequence homology

3 討論與結(jié)論

國(guó)內(nèi)外有關(guān)生防細(xì)菌的研究報(bào)道較多。生防細(xì)菌繁殖速度快、周期短，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，且代謝產(chǎn)物多樣、活動(dòng)復(fù)雜，在生物防治中起著非常重要的作用[21-22]。生防細(xì)菌中研究較多的為芽孢桿菌屬(Bacillus)與假單胞菌屬(Pseudomonas)，芽孢桿菌作為外源添加菌劑，易定殖于植物，同根部病害病原菌形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，細(xì)菌分泌代謝物可以抑制病原菌生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物抗性，降低病害發(fā)生率[23-24]。姚鳳琴等[25]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Bv17 對(duì)可以防治非洲菊(Gerbera jamesonii)根腐病，且相對(duì)防效高達(dá)70%，當(dāng)其濃度為5 × 107cfu·mL?1時(shí)防治效果可達(dá)97.32%。而本研究篩選出的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) DRT-8、蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides) DRT-3，抑菌率均達(dá)到70%。而假單胞菌能有效抑制多種病原真菌孢子的萌發(fā)、游動(dòng)孢子囊的產(chǎn)生以及病原菌的菌絲生長(zhǎng)[26-27]，抑制病害同時(shí)還可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)產(chǎn)生的藤黃酚等次級(jí)代謝產(chǎn)物能有效抑制煙草根黑腐病的發(fā)生[28]。從熒光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 等菌株中分離純化的嗜鐵素可以有效抑制黃曲霉 (Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)等病原菌的生長(zhǎng)[29-30]，降低病害發(fā)生率。本研究篩選出的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)與其他拮抗菌相比，抑菌能力突出，抑菌率達(dá)89.40%和91.16%，后期對(duì)其產(chǎn)鐵載體能力，有待進(jìn)一步研究。

生防菌防治對(duì)比化學(xué)藥劑防治更加綠色、高效，對(duì)環(huán)境安全和人畜的健康更有保障。以前，學(xué)者們分離篩選生防菌資源主要利用具有拮抗作用的放線菌，近年來(lái)，更多的研究人員發(fā)現(xiàn)植物根際促生菌是一種更理想的生防菌來(lái)源，但由于生防菌篩選還未尋找到合適的選擇性培養(yǎng)基，從而選擇具有優(yōu)良促生特性的菌株同時(shí)研究其生防效果，從而達(dá)到篩選優(yōu)良菌株的目的。張夢(mèng)琦等[31]分離篩選出一株多功能根際促生菌DD3，兼具溶磷、產(chǎn)鐵載體等能力，對(duì)大蒜(Allium sativum)根腐病抗病能力有所提高，同時(shí)有效提升大蒜生長(zhǎng)的農(nóng)藝性狀。撖冬榮等[14]研究發(fā)現(xiàn)醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus) MGBC3，具有溶磷、分泌激素的能力，對(duì)黃瓜枯萎病(Fusarium oxysporum)有較強(qiáng)抑制作用。本研究篩選出的菌株中，DRT-3、DRT-11、DRT-17兼具溶磷、固氮、分泌激素的能力，且抑菌能力較強(qiáng)，后期對(duì)其促生及生防機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究從燕麥根際分離篩選到了6 株抑菌能力較強(qiáng)的菌株，抑菌率最高為91.16%，篩選出具有固氮能力的菌株有5 株，固氮酶活性在51.82～210.81 nmol·(h·mL)?1(C2H4)，具 有 溶 無(wú) 機(jī) 磷 能 力 的菌株有5 株，溶磷量在46.14～135.47 μg·mL?1，菌株中只有菌株DRT-3、DRT-11、DRT-17 具有溶解有機(jī)磷的能力，溶磷量為21.64、31.65 和28.64 μg·mL?1，具有分泌IAA 能力的菌株6 株，分泌量在41.74～157.28 μg·mL?1。其中DRT-17 分泌植物激素的量最強(qiáng)，且具有較強(qiáng)的抑菌效果，對(duì)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，菌株DRT-2、DRT-8 為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，DRT-3 為蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)，DRT-11為不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.)，菌株DRT-17、DRT-18為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。