龐可心 王培 朱敏 陸芬 湯健 張 麗

南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科（江蘇南京 210008）

伴有痙攣性雙癱和視覺缺陷的神經(jīng)發(fā)育障礙(neurodevelopmental disorder with spastic diplegia and visual defects，NEDSDV；OMIM：#615075)是一種非常罕見的常染色體顯性遺傳病，2012年由de Ligt等[1]首次報道，他們對100 例智力障礙患者進行家系全外顯子檢測，首次確定了CTNNB 1功能缺失變異可導(dǎo)致智力障礙(intellectual disability,ID)，推測該基因為新的ID 基因（OMIM：*116806），相關(guān)疾病表型命名為常染色體顯性精神智力發(fā)育遲滯19型（autosomal dominant mental retardation type 19,MRD 19），其主要臨床表現(xiàn)為嚴重的智力障礙、神經(jīng)性語言障礙、小頭畸形、輕度面部畸形、痙攣性雙癱。2014年Kuechler等[2]發(fā)現(xiàn)其他臨床表現(xiàn)，如斜視或遠視、滲出性視網(wǎng)膜病變等，將MRD 19 更名為NEDSDV。目前該病在國內(nèi)文獻尚未見報道?，F(xiàn)報告5 例CTNNB 1基因變異所致NEDSDV，并結(jié)合已有文獻進行復(fù)習(xí)，以提高臨床醫(yī)師對該病的認識。

1 臨床資料

回顧性選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科2014年1月至2020年3月收治的5例患兒，其中男4例，女1例，就診年齡為6個月至2歲8個月，5例患兒均因運動及認知發(fā)育落后就診。其中例1 患兒為35周剖宮產(chǎn)，低體質(zhì)量兒(2kg)；例5患兒母親于孕5～6月患有陰道炎，孕中期產(chǎn)檢提示雙頂徑小，加強營養(yǎng)半月后復(fù)查正常，母孕7月患有智齒炎，輸注青霉素抗感染治療3天好轉(zhuǎn)，余3例患兒母孕期及出生史均無異常。5例患兒分別來自5個家庭，均無陽性家族史，父母均非近親婚配。見表1。

表1 5例NEDSDV患兒臨床資料及基因檢測結(jié)果

除例5外，4例患兒均以全面性發(fā)育遲緩為發(fā)病特征，包括運動、認知及語言發(fā)育落后；所有患兒均表現(xiàn)出顯著的下肢痙攣性截癱特征：屈髖、膝反張、上肢遠端及雙下肢肌張力增高（例1患兒6月齡初次就診時下肢肌張力障礙不明顯，隨著年齡增長，雙下肢肌張力進行性增高，余4 例患兒隨著年齡增加均表現(xiàn)為雙下肢肌張力增高）。

5例患兒表現(xiàn)為頭圍較正常同齡兒小，其中例1、例3 頭圍位于正常同齡兒頭圍標準-3 SD，例2、例4 頭圍位于正常同齡兒頭圍標準差-3 SD 至-2 SD之間，例5 頭圍位于正常同齡兒頭圍標準差-2 SD至-1 SD 之間。所有患兒均有輕度面部畸形，包括上唇唇紅過薄、人中長、高腭弓等；其中例1、例2、例3存在皮膚白皙，例4患兒有小鼻翼，例1、例2、例5存在雙眼斜視，例3存在右眼斜視。此外，例1患兒表現(xiàn)為眼裂小，高度遠視、雙足趾長；例2表現(xiàn)為雙上眼瞼下垂、左手通貫掌；例5患兒表現(xiàn)為左側(cè)眼瞼下垂，有顯著的先天性眼視網(wǎng)膜異常，表現(xiàn)為滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變，患兒生后既發(fā)現(xiàn)不能追視，外院診斷“雙眼家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變、雙眼滲出性視網(wǎng)膜脫離”，先后于2017年7月、2018年6月在上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院行“晶狀體切除術(shù)”，2019年6月在鎮(zhèn)江瑞康醫(yī)院行“左眼PPV術(shù)”；例3有情緒控制欠佳，易激惹。5例患兒未發(fā)現(xiàn)自閉癥特征（可能與年齡有關(guān)）。5例患兒頭顱MRI表現(xiàn)，除例5發(fā)現(xiàn)胼胝體壓部略薄外，余4例未見明顯異常。

為明確病因，經(jīng)南京市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準（No.202105048-1），患兒監(jiān)護人簽署知情同意書后分別抽取患兒及其父母靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，使用血液基因組柱式中量提取試劑盒（康為世紀）提取基因組DNA。由北京全譜醫(yī)學(xué)檢驗實驗室公司進行先證者全外顯子組測序（WES），采用IDT 公司xGen?Exome Research Panel v1.0捕獲探針與gDNA文庫序列進行液體雜交，將目標區(qū)域DNA 片段進行富集，構(gòu)建全外顯子文庫，捕獲文庫通過illumina 公司 NovaSeq 6000系列測序儀進行高通量測序V，測序數(shù)據(jù)使用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)軟件與Ensemble參考基因組GRCh37/hg19比對；然后使用GATK 軟件分析出SNP、Indel；最后根據(jù)測序深度、變異質(zhì)量對檢測到的SNP、Indel 進行過濾和篩選，得到高質(zhì)量可靠的變異，使用自主開發(fā)的變異注釋軟件對檢測到的高質(zhì)量變異進行各大數(shù)據(jù)庫（如 dbSNP、千人基因組、ExAC、ESP 等頻率數(shù)據(jù)庫及OMIM、HGMD、ClinVar等）的關(guān)聯(lián)注釋。借助Provean、SIFT、Polyphen2-HVAR、Polyphen2-HDIV、M-Cap、Revel、Mutationtaster等蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件，MaxEntScan剪切位點預(yù)測軟件等對其危害性進行分析，篩選出對蛋白結(jié)構(gòu)可能有有害影響的變異。并按照2015年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會（ACMG）診斷指南和2018年《臨床單基因遺傳病基因檢測報告規(guī)范》對變異位點進行致病性分析。對患兒及其父母目標序列進行Sanger測序驗證，并進行家系傳遞分析。

WES 結(jié)果，例1CTNNB 1基因9 號外顯子存在c.1420 C＞T(p.R 474 X)雜合變異，導(dǎo)致其編碼的蛋白在第474 位氨基酸提前引入終止密碼子，產(chǎn)生截短蛋白。例2CTNNB 1基因10 號外顯子存在c.1543 C＞T(p.R 515 X)雜合變異，導(dǎo)致其編碼的蛋白在第515 位氨基酸提前引入終止密碼子，產(chǎn)生截短蛋白。例3CTNNB 1基因4 號外顯子存在c.478_479insTAAATGA(p.E163Kfs*2)雜合變異，表示該基因編碼區(qū)第478至第479之間插入堿基序列TAAATGA，導(dǎo)致其編碼的蛋白從第163位氨基酸開始發(fā)生移碼，并在第164位提前引入終止密碼子，產(chǎn)生截短蛋白。例4CTNNB1基因13號外顯子存在c.1973dupT(p.L659Ffs*6)雜合變異，該移碼變異導(dǎo)致其編碼的蛋白從第659位氨基酸開始算起，后再翻譯6個氨基酸即終止，產(chǎn)生截短蛋白。例5CTNNB1基因5號外顯子存在c.625G＞T(p.E209X)雜合變異，導(dǎo)致其編碼的蛋白在第209位氨基酸提前引入終止密碼子，產(chǎn)生截短蛋白(圖1)。對5例患兒及其父母進行Sanger驗證，發(fā)現(xiàn)患兒攜帶CTNNB1基因雜合變異，而其父母均未檢測到相同變異，提示上述5個CTNNB1基因變異為新發(fā)變異。按照ACMG指南對該變異進行分析，5個變異為無義變異或移碼變異，為功能缺失型變異，導(dǎo)致基因功能可能喪失，且為經(jīng)雙親驗證的新發(fā)變異。正常對照人群數(shù)據(jù)庫（Exome Sequencing Project，1000 Genomes Project，dbSNP等數(shù)據(jù)庫）中均未發(fā)現(xiàn)這些變異。先證者為雜合新發(fā)變異，符合常染色體顯性遺傳（AD）疾病發(fā)病機制，且先證者及其父母表型及基因型符合共分離，臨床表型匹配，考慮上述5個變異為致病性變異。

圖1 5 例NEDSDV 患兒CTNNB1 基因變異Sanger 測序圖

2 討論

以“CTNNB 1”或“NEDSDV”、“CTNNB 1”或“MRD19”為關(guān)鍵詞在中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺及PubMed數(shù)據(jù)庫2001年4月至2020年12月收錄的文獻進行檢索，篩選條件為文中描述了臨床表現(xiàn)及經(jīng)基因診斷NEDSDV。共檢索到符合條件的10篇文獻，共39 例患者(其中有5 例成人案例)。均為國外文獻報道，國內(nèi)文獻未見報道。

文獻中34 例兒童NEDSDV 患者均有不同程度的智力障礙、運動發(fā)育遲緩及小頭畸形、顏面部畸形（34 例），言語障礙30 例，軸性低張力30 例，周圍性肌張力增高29 例，情緒及行為異常21 例，視覺缺陷（22 例斜視或遠視），全部患兒均無癲癇發(fā)作。其他以骨骼系統(tǒng)表現(xiàn)常見，骨骼發(fā)育異常7 例，如脊柱側(cè)彎（3 例）、脊髓栓系（2 例）、脊髓空洞癥（1例）、髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良（2例）、腓骨長而扁平（2 例）、手指腳趾細長（2 例）,多指畸形（1 例）。此外，與這些患者相關(guān)的非特異性表型，包括進食困難（7 例）、睡眠障礙（7 例）、宮內(nèi)發(fā)育遲緩（6 例）、ADHD（3例）[2-10]。

34例NEDSDV患兒均為CTNNB1基因變異（其中兩例未得到記錄），其中顯性變異32 例。共包含26種變異，包括無義變異（18）、移碼變異（9）、剪接 位點變異（2）、全基因缺失（2）、錯義變異（1）。其中c.1420C＞T/p.R474X及c.1603C＞T/p.R535X為有多例報導(dǎo)的熱點變異（分別為3例）[2-10]。

NEDSDV核心表型（core phenotype）包括神經(jīng)發(fā)育遲緩及其導(dǎo)致的智力障礙、神經(jīng)性語言障礙、小頭畸形、輕度面部畸形和痙攣性對稱性肢體癱瘓，這與本組患兒高度一致。本組5 例患兒均有以語言功能障礙為特征的神經(jīng)發(fā)育遲緩，2例有顯著的小頭畸形（小于正常同齡兒童頭圍的3 個標準差），而在臨床上均表現(xiàn)出痙攣性雙下肢癱瘓?zhí)卣?，雙下肢肌張力增高，從而呈現(xiàn)出髖、膝、踝關(guān)節(jié)形態(tài)和姿勢異常。最近，Jin 等[11]在臨床腦癱研究中也將CTNNB 1作為一個重要的候選基因。本研究中僅例5 表現(xiàn)出嬰兒期發(fā)病的滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變，而其余患兒僅表現(xiàn)為斜視，未見眼底病變，這可能提示特異基因型-眼病變的關(guān)聯(lián)性。總之，通過對本組5例患兒分析發(fā)現(xiàn)，NEDSDV 患者的臨床特征為“伴有痙攣性雙癱和小頭畸形的神經(jīng)/精神發(fā)育遲緩”，這些特征的出現(xiàn)為臨床醫(yī)師能及早發(fā)現(xiàn)該疾病提供了警示。

Dixon 等[12]發(fā)現(xiàn)1 例22 月齡男孩CTNNB 1無義變異(c.2112_2116dupAGAAC[ p.P706Qfs*31])與家族相關(guān)的滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變（FEVR）表型相關(guān)，同時具有全面性發(fā)育遲緩。2020 年Ke等[3]的報道中，熱點致病變異p.R 535 X 患者出現(xiàn)視網(wǎng)膜脫落，而在歐洲報道的2 例患者中均有視網(wǎng)膜病變[6]。因此，本研究鑒定新變異p.E 209 X 是否與視網(wǎng)膜病變存在關(guān)聯(lián)傾向，或與其他遺傳性因素有關(guān)，還有待更多病例的證據(jù)支持。然而，最近Coussa 等[13]發(fā)現(xiàn)2 月齡患兒FEVR 同時伴小頭畸形存在CTNNB 1無義變異（c.2046_2047 del[p.Phe683Glnfs*9]）。Sun等在FEVR和Norrie?。ǚ謩e為遺傳性視網(wǎng)膜和視神經(jīng)?。┗颊咧需b定了4 個CTNNB1基因胚系無義變異，p.Y333X、p.H369Tfs*2、p.L580Tfs*28和p.Q623X[1-2]，與本研究鑒定變異位點均無重疊，在以往典型的NEDSDV西方案例中也沒有發(fā)現(xiàn)。CTNNB1基因編碼的蛋白質(zhì)β-Catenin是Wnt信號通路的最終效應(yīng)分子，該通路在細胞增殖中發(fā)揮重要作用，Wnt 通路異常與結(jié)腸癌、FEVE等發(fā)育異常疾病相關(guān)[12]。β-Catenin活性減少會導(dǎo)致Norrin/β-連環(huán)蛋白通路異常[14]，而在Zhu等[15]的研究中，CTNNB1基因異常激活，Norrin/β-連環(huán)蛋白表達異常活躍同樣會導(dǎo)致視網(wǎng)膜上血管生長遲緩和視網(wǎng)膜深層垂直血管生長缺陷，這表明β-連環(huán)蛋白需在一定范圍內(nèi)精準表達，在Norrin/β-Catenin通路中發(fā)揮核心作用，是導(dǎo)致FEVE 發(fā)病的關(guān)鍵蛋白。目前所知的CTNNB 1基因變異中，導(dǎo)致眼部癥狀的變異與無眼部癥狀的變異基因位點位置上或變異類型上無明顯差異，且FEVE 病例較少，大多數(shù)CTNNB 1變異患者缺乏詳細的眼底描述，故無法獲得明確的基因型-表型相關(guān)性[16]。

CTNNB1基因位于人類染色體3q22.1，其典型轉(zhuǎn)錄本（NM_001904）包含14個蛋白編碼外顯子，編碼781個氨基酸殘基的β1連環(huán)蛋白（Catenin-beta1,β-Catenin），是介導(dǎo)細胞黏附的鈣黏蛋白黏附復(fù)合物的一個組成部分，其介導(dǎo)細胞間黏附，也是典型Wnt信號通路的關(guān)鍵下游分子。Wnt家族分泌的糖蛋白高度保守，在包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的細胞過程中調(diào)節(jié)細胞通訊，CTNNB 1則是這一途徑的核心調(diào)控分子，通過參與許多基因調(diào)控的TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，在多系統(tǒng)和組織中（包括正常組織和腫瘤組織）起到細胞生長和分化的調(diào)控作用。在丘腦中，β-Catenin調(diào)節(jié)與神經(jīng)元興奮相關(guān)蛋白的表達。β-連環(huán)蛋白也被發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)元樹突發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控分子。動物實驗表明，敲除小鼠CTNNB1基因，小鼠表現(xiàn)出焦慮、認知及社會行為受損、重復(fù)刻板行為增加，這與人類自閉癥譜系障礙（ASD）核心癥狀相似[17]。Tucci等[18]通過C-端變異p.T653K造成了除精神行為改變以外的小鼠運動障礙，而在其他多數(shù)動物實驗中少見，顯示出與人類NEDSDV腦性癱瘓的特征有顯著不同。此外，C-端錯義變異造成了小鼠顯著的腦器質(zhì)性改變，皮層和海馬結(jié)構(gòu)體積減小，以及胼胝體發(fā)育不良，這也與人類NEDSDV有明顯不同，但未來新鑒定案例應(yīng)關(guān)注腦影像學(xué)的改變。本研究病例均未見特異性腦影像學(xué)異常，僅有腦體積減?。ɡ? 胼胝體壓部略?。?，是否具有特征性還有待更多病例以及新變異的發(fā)現(xiàn)和總結(jié)。經(jīng)研究表明，CTNNB 1在顱腦及顏面部發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Brault等[19]構(gòu)建的攜帶CTNNB1變異基因雜合子小鼠均表現(xiàn)出明顯的腦及面部發(fā)育畸形，并表明β-Catenin在腦形態(tài)發(fā)生和形成顱神經(jīng)干細胞衍生的顱面結(jié)構(gòu)中是必需的?？傊ㄟ^功能研究顯示了CTNNB1的高度保守和在神經(jīng)元發(fā)育中的重要作用。

目前NEDSDV 尚無特效治療，大部分患者預(yù)后較差，所有患者均有運動發(fā)育遲緩及語言發(fā)育遲緩（輕度或嚴重），很大可能不能獨立行走，部分患者可獨立行走，最早的行走年齡為2.5歲，但步態(tài)不穩(wěn)，常呈不穩(wěn)定、共濟失調(diào)或痙攣形態(tài)。大多數(shù)患者（約75%）有視力障礙，多為斜視或/和遠視、近視等。約57%患者后期出現(xiàn)行為問題，睡眠障礙和攻擊性行為表現(xiàn)較常見。文獻報道及本組5 例患兒均無癲癇發(fā)作的表現(xiàn)，腦電圖均正常[2,6]?；純航^大多數(shù)有運動、認知落后以及軀干肌張力低下及雙下肢痙攣性雙癱，可進行對癥治療及個體化綜合康復(fù)治療，包括運動功能、認知功能的訓(xùn)練和理療等，盡可能減輕發(fā)育落后的程度。對于斜視和遠視，可佩帶眼鏡或行矯正手術(shù)，定期評估患兒視力。對于家族相關(guān)的滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變，要盡早進行PPV術(shù)或激光治療。目前沒有NEDSDV 對壽命影響的報道，以往報道表明患兒可以存活到成人。許多報道中CTNNB1變異為體細胞功能獲得變異，常與腫瘤相關(guān)，而本組5 例變異不能排除患兒父母為生殖細胞嵌合攜帶者的可能性，必要時需進行超高深度擴增子測序。NEDSDV 患兒父母再生育時須進行遺傳咨詢。

本研究鑒定了3個未報道過的CTNNB1基因致病性變異：c.478_479insTAAATGA、c.1973dupT和p.E209X，除p.E209X和早發(fā)性視網(wǎng)膜病變存在可疑關(guān)聯(lián)，均表現(xiàn)出典型NEDSDV 臨床表現(xiàn)。本研究擴展了NEDSDV的致病性變異譜。