王峽 代繼宏 田代印 應(yīng)林燕 符州 李瑩

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科 國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶 400014）

單基因病又稱(chēng)孟德?tīng)栠z傳病，是由一對(duì)等位基因控制的疾病。呼吸系統(tǒng)單基因病包括直接起源于肺部（累及氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺間質(zhì)）的疾病和累及呼吸系統(tǒng)的其他遺傳病[1]。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，靶向多基因面板測(cè)序和全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing，WES）等二代測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于兒童遺傳病的診斷。隨著越來(lái)越多的疑難罕見(jiàn)病在分子層面得以確診，目前認(rèn)為既往有低估其發(fā)病率的可能。但是與神經(jīng)、腫瘤、內(nèi)分泌、免疫等學(xué)科相比，基因二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）在輔助診斷兒童呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用尚處于起步階段，其作用需要進(jìn)一步探索。本研究對(duì)97例臨床診斷不明的呼吸系統(tǒng)疾病患兒的臨床表現(xiàn)及基因二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，旨在研究NGS在兒童呼吸系統(tǒng)疑難疾病中的診斷作用。其中測(cè)序結(jié)果根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics，ACMG）對(duì)基因變異解讀指南，利用多種生物信息學(xué)軟件結(jié)合臨床表型分析數(shù)據(jù)，從而明確致病/可能致病性基因變異。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性收集2016年1月—2021年10月年重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸中心收治的以呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)為主的患兒的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡0～18歲；②臨床診斷不明或常規(guī)治療效果欠佳；③符合基因檢測(cè)指征并完善了基因檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：病例資料有缺失者。

基因檢測(cè)指征：①反復(fù)呼吸道感染/慢性咳嗽常規(guī)抗感染治療效果不佳，伴/不伴內(nèi)臟轉(zhuǎn)位，臨床疑診原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙（primary ciliary dyskinesia，PCD）、囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）；②不明原因氣促、呼吸窘迫，胸部影像學(xué)改變?yōu)閺浡苑伍g質(zhì)病變；③不明原因支氣管擴(kuò)張；④起病年齡小，肺炎重且合并其他系統(tǒng)受累（如發(fā)育遲緩、特殊面容）。

本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號(hào)：（2022）年倫審（研）第（6）號(hào)]，同時(shí)患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 使用標(biāo)準(zhǔn)化表格收集數(shù)據(jù)，包括一般人口學(xué)資料、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查結(jié)果、基因檢測(cè)結(jié)果等。數(shù)據(jù)從臨床記錄中進(jìn)行回顧性檢索，或通過(guò)聯(lián)系患兒家屬獲得。

1.2.2 基因檢測(cè)方法 抽取患兒外周血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，行WES或呼吸系統(tǒng)疾病基因包測(cè)序（帶或不帶拷貝數(shù)變異分析），通過(guò) Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證并分析變異來(lái)源。基因檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：按照ACMG標(biāo)準(zhǔn)，變異符合分離規(guī)律，即在顯性遺傳模式的基因中檢測(cè)到雜合變異，或在隱性遺傳模式的基因中檢測(cè)到純合子/復(fù)合雜合變異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)計(jì)量資料以中位數(shù)（M）（全距）表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共102例患兒符合納入標(biāo)準(zhǔn)，排除5例臨床資料不全者，最終納入97例患兒進(jìn)行基因二代測(cè)序。男57例、女40例，樣本采集時(shí)中位年齡為1.9（7.6）歲。80例進(jìn)行了WES檢查，17例行呼吸系統(tǒng)疾病基因包檢查，9例行拷貝數(shù)變異分析，65例患兒父母同時(shí)接受基因測(cè)序。根據(jù)患兒臨床表型及影像學(xué)特點(diǎn)可初步分為肺實(shí)質(zhì)病變和肺間質(zhì)病變兩組。其中89例表現(xiàn)為慢性濕性咳嗽，CT提示支氣管擴(kuò)張、肺不張、肺實(shí)變，納入肺實(shí)質(zhì)病變組；8例表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的氣促、發(fā)紺，不伴明顯咳嗽，CT 提示廣泛肺間質(zhì)改變，納入肺間質(zhì)病變組。

2.2 臨床特征

通過(guò)基因檢測(cè)確診呼吸系統(tǒng)單基因病共31例，診斷率32.0%，男16例、女15例，中位年齡4.0（7.6）歲。其中肺實(shí)質(zhì)病變組28例，包括PCD 20例，CF 4例，原發(fā)性免疫缺陷?。╬rimary immunodeficiency disease，PID）2例，神經(jīng)肌肉疾病（neuromuscular disease，NMD）2例；肺間質(zhì)病變組3例（均為肺表面活性物質(zhì)代謝障礙）。2018年之前診斷4例，2018年之后診斷27 例。PCD、CF 患兒均以反復(fù)咳嗽、咳痰為主要表現(xiàn)，部分PCD 患兒合并有鼻竇炎、中耳炎，肺表面活性物質(zhì)代謝障礙患兒以氣促、發(fā)紺為主要表現(xiàn)，PID患兒以反復(fù)呼吸道感染為主要表現(xiàn)，無(wú)明顯其他系統(tǒng)感染病史及陽(yáng)性家族史，NMD患兒以反復(fù)呼吸道感染伴/不伴肌無(wú)力為主要表現(xiàn)。經(jīng)胸部CT 證實(shí)，PCD、CF 患兒主要累及肺實(shí)質(zhì)，肺表面活性物質(zhì)代謝障礙則以肺間質(zhì)受累為主。NGS 檢測(cè)結(jié)果陰性患兒以反復(fù)呼吸道感染和慢性咳嗽表現(xiàn)為主，伴/不伴支氣管擴(kuò)張；部分患兒表現(xiàn)為不明原因氣促、呼吸窘迫，伴/不伴肺部廣泛間質(zhì)改變。見(jiàn)表1、表2。典型病例的影像學(xué)表現(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 典型病例胸部CT 表現(xiàn)

表1 肺實(shí)質(zhì)病變組患兒臨床特征

表2 肺間質(zhì)病變組患兒臨床特征

2.3 基因檢測(cè)結(jié)果

PCD 主要為常染色體隱性遺傳，18 例為復(fù)合雜合變異（HYDIN7例、CCNO3例、CCDC402例、DNAH12例、DNAAF31例、DNAI21例、DNAH111例、RSPH4A1例）；1例為DNAI2基因純合變異；1 例存在X 連鎖PIH 1 D 3基因半合子缺失。以錯(cuò)義變異為主，少部分為移碼變異、剪接變異、無(wú)義變異。肺表面活性物質(zhì)代謝障礙均為SFPTC基因雜合變異，均為常染色體顯性遺傳。CF 4 例均為常染色體隱性遺傳，3 例為CFTR基因復(fù)合雜合變異，1例為CFTR基因c.4056 G＞C 純合變異。2 例PID 患兒均為常染色體顯性遺傳，分別為PIK 3 CD基因雜合變異所致PI 3 Kδ 過(guò)度活化綜合征（activatedphosphoinositide 3-kinase-δ syndrome，APDS）、CXCR4基因雜合變異所致WHIM綜合征。2例NMD患兒分別為MTM1基因變異所致X連鎖隱性遺傳致中央核肌病、SMN 1基因純合缺失致常染色體隱性遺傳進(jìn)行性脊肌萎縮癥。

確診的31例患兒（包括2例純合子），父母均非近親婚配，1例患兒 Xq22.3 區(qū)域存在半合子缺失，其弟弟同樣檢測(cè)出該缺失（因未在本院就診缺乏臨床數(shù)據(jù)），進(jìn)一步分析該變異來(lái)自其母親。另有2 例患兒為同胞姐弟，臨床表型相似，均起病于新生兒期，合并有鼻竇炎、中耳炎，肺功能均提示輕度阻塞，但弟弟有卵圓孔未閉、全內(nèi)臟轉(zhuǎn)位，基因檢測(cè)均提示CCDC 40復(fù)合雜合變異。其余患兒父母、家庭其他成員均無(wú)類(lèi)似病史。

2.4 相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查

31例患兒均完善了痰液或支氣管肺泡灌洗液的病原學(xué)培養(yǎng)，20例呈陽(yáng)性（64.5%），最常見(jiàn)的細(xì)菌分離株是流感嗜血桿菌（9例）和肺炎鏈球菌（5例）。9例PCD患兒肺功能檢查提示為阻塞性通氣功能障礙，2 例肺表面活性物質(zhì)代謝障礙患兒肺功能檢查提示限制性通氣功能障礙。2例PID患兒進(jìn)行了免疫功能篩查（免疫球蛋白、白細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)、淋巴細(xì)胞分類(lèi)及計(jì)數(shù)），免疫球蛋白水平均無(wú)明顯異常；WHIM 綜合征患兒的淋巴細(xì)胞免疫表型為 CD 3+、CD 19+細(xì)胞減少；PI 3 Kδ 過(guò)度活化綜合征患兒CD19+細(xì)胞減少。5例患兒行鼻呼出氣一氧化氮檢測(cè)（fractional exhaled nitric oxide，F(xiàn)eNO），結(jié)果顯示4例PCD患兒的中位FeNO值為30ppb（最小值4ppb，最大值213ppb），1例CF的FeNO值為156ppb。10例PCD 患兒接受了纖毛電鏡檢查，2 例纖毛結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，2例未見(jiàn)纖毛細(xì)胞，4例表現(xiàn)為纖毛數(shù)量減少，2例表現(xiàn)為微管排列不規(guī)則、內(nèi)外動(dòng)力臂缺失。

2.5 基因檢查結(jié)果對(duì)臨床診斷及治療的影響

97例患兒中肺實(shí)質(zhì)病變組89例，基因診斷前臨床診斷主要考慮PID、PCD 和CF，最后通過(guò)基因確診PCD20例、CF4例、PID2例、NMD2例，診斷率為31.5%。肺間質(zhì)病變組8例，基因診斷前臨床診斷廣泛肺間質(zhì)病變（原因不清），基因檢測(cè)確診為肺表面活性物質(zhì)代謝障礙2型3例，診斷率37.5%。1例PID（WHIM綜合征）患兒經(jīng)基因檢測(cè)確診后轉(zhuǎn)診至免疫專(zhuān)科繼續(xù)治療、隨訪，1 例APDS、2 例NMD、3 例肺表面活性物質(zhì)代謝障礙患兒因病情重、預(yù)后差、家庭經(jīng)濟(jì)情況等因素放棄治療出院。

3 討論

兒童疑難罕見(jiàn)病多是遺傳性疾病，其中單基因病又被稱(chēng)為孟德?tīng)栠z傳病，由明確的單個(gè)基因變異而引起臨床表現(xiàn)。呼吸系統(tǒng)單基因遺傳病種類(lèi)多，包括肺部原發(fā)性疾病以及有肺部受累的其他遺傳病。由于其較少被關(guān)注且臨床表型缺乏特異性，容易漏診。近年來(lái)，分子生物學(xué)尤其是二代基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，測(cè)序成本不斷降低，許多呼吸系統(tǒng)疑難病的診斷取得了突破性進(jìn)展。有研究表明，對(duì)于臨床表型復(fù)雜的疑難病，采用WES的診斷陽(yáng)性率可達(dá)28.8%[2]。本研究97例患兒的總體診斷率為32.0%，與以往研究類(lèi)似[3]。診斷疾病譜包括：PCD 20 例（64.5%），CF4例（12.9%），肺表面活性物質(zhì)代謝障礙 3例（9.7%），PID 2例（6.5%），NMD 2例（6.5%）。通過(guò)NGS 測(cè)序本組確診病例中原發(fā)于肺部的單基因遺傳病以PCD最多見(jiàn)，結(jié)合北京兒童醫(yī)院研究結(jié)果[3]，推測(cè)在中國(guó)兒童群體中，PCD可能是最常見(jiàn)的原發(fā)于肺部的單基因遺傳病。在本研究中，有66例基因檢測(cè)結(jié)果為陰性，進(jìn)一步分析這些病例，發(fā)現(xiàn)有部分檢測(cè)出單個(gè)相關(guān)的異?；颉７治鲈蚩赡苁鞘芟抻诂F(xiàn)有的檢測(cè)手段，或存在未被證實(shí)的基因遺傳模式。

過(guò)去，透射電子顯微鏡下典型的超微結(jié)構(gòu)缺陷為診斷PCD 的金標(biāo)準(zhǔn)，然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)約1/3 PCD 患者纖毛超微結(jié)構(gòu)正常[4]。本研究完善纖毛電鏡檢查的患兒也有1/5 未見(jiàn)異常，說(shuō)明僅依靠電鏡檢查會(huì)漏診部分患者。纖毛的超微結(jié)構(gòu)改變可能是PCD特有，也可能與呼吸道感染或暴露于環(huán)境污染物中的獲得性變化部分重疊[5]。而鼻FeNO、高速視頻顯微鏡分析、針對(duì)纖毛蛋白的免疫熒光檢測(cè)等靈敏度和特異度有限，復(fù)雜且價(jià)格昂貴，未在臨床中廣泛開(kāi)展[6-7]，因此基因診斷在PCD 中有不可或缺的作用。同時(shí)，區(qū)別于國(guó)外某些近親結(jié)婚率高的地區(qū)致病變異較單一[8]，國(guó)內(nèi)PCD 患者具有較顯著的基因異質(zhì)性和基因變異異質(zhì)性，因此在選擇基因檢測(cè)時(shí)仍應(yīng)以WES 為主。在WES 未找到令人信服的致病變異的情況下，則可以選擇進(jìn)一步針對(duì)PCD 相關(guān)候選基因的拷貝數(shù)變異靶向分析或低深度的全基因重組測(cè)序分析可能發(fā)生于深度內(nèi)含子的變異[9]。

CF 在國(guó)內(nèi)較為罕見(jiàn)，尚無(wú)發(fā)病率的相關(guān)數(shù)據(jù)，僅有散發(fā)病例報(bào)道[10]，且國(guó)內(nèi)CF 患者以呼吸系統(tǒng)受累為主，消化系統(tǒng)癥狀輕微，僅憑臨床表現(xiàn)及常規(guī)的輔助檢查難以與PCD 區(qū)分。國(guó)內(nèi)汗液試驗(yàn)開(kāi)展較少，基因檢測(cè)安全易行，對(duì)于中國(guó)CF 患者具有更重要的意義。針對(duì)CF的基因檢測(cè)，國(guó)外多采用對(duì)CFTR基因已知的常見(jiàn)特異性變異進(jìn)行檢測(cè)[11]。我國(guó)關(guān)于CFTR變異的報(bào)道多為少見(jiàn)變異、變異范圍廣泛，具有遺傳多樣性，可選擇參照標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行CFTR全基因測(cè)序，有利于檢測(cè)少見(jiàn)變異，甚至發(fā)現(xiàn)新的致病性變異。

以肺表面活性物質(zhì)代謝障礙為代表的則是一組異質(zhì)性的以肺間質(zhì)受累為主的疾病，臨床主要表現(xiàn)為氣促、發(fā)紺，目前發(fā)現(xiàn)的主要變異基因有SFTPA 1、SFTPA 2、SFTPB、SFTPC、ABCA 3和NKX2-1[12]。雖然這類(lèi)疾病的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查結(jié)合纖維支氣管鏡或肺活檢的病理檢查結(jié)果，但在以氣促、彌漫性肺部間質(zhì)性改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的疾病，病因多且復(fù)雜，基因檢測(cè)可快速作出診斷，避免有創(chuàng)操作及其他檢查花費(fèi)。

盡管目前對(duì)遺傳性疾病治療的研究有限，缺乏對(duì)因治療的方法，但在分子層面確診對(duì)不同基因型致病的機(jī)制、基因變異與特定信號(hào)通路聯(lián)系的探索至關(guān)重要，也為生物制劑和小分子調(diào)節(jié)劑靶向治療提供依據(jù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。針對(duì)CF、PID某些特定位點(diǎn)變異已有針對(duì)基因的治療[13-14]。此外，基因檢測(cè)不僅可明確診斷、指導(dǎo)治療，還可擴(kuò)展到對(duì)受影響的個(gè)人及其家庭成員進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪z傳咨詢(xún)。

基因檢測(cè)雖然在兒童呼吸系統(tǒng)疑難疾病的診斷中具有較大優(yōu)勢(shì)，但在實(shí)際應(yīng)用中，仍存在明顯的局限性。首先使用有針對(duì)性的基因測(cè)序包可減少脫靶，但由于部分疾病的遺傳異質(zhì)性高（如PCD、PID），可能導(dǎo)致漏診。研究表明，目前分子診斷在PID 及PCD的陽(yáng)性率僅50.0%左右[15-16]。其次，NGS允許更多的基因被平行測(cè)序，測(cè)試的敏感性增加，但其特異性降低。每個(gè)個(gè)體中存在的良性遺傳變異的數(shù)量增加使得過(guò)度診斷的可能性很大，且隨著測(cè)試規(guī)模的增加而增加。此外，目前商業(yè)化的NGS 多為外顯子測(cè)序及目標(biāo)基因包檢測(cè)，無(wú)法通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)深度內(nèi)含子等部位的變異。部分疾病致病機(jī)制可能為位于不同基因上的變異構(gòu)成的雙基因遺傳模式，進(jìn)一步增加了基因診斷的難度。最后，NGS 技術(shù)價(jià)格昂貴、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、解釋結(jié)果并非絕對(duì)可靠、許多基因疾病并無(wú)特異性治療手段，無(wú)法在臨床大規(guī)模推廣。此外，本研究還存在其他局限性，為單中心、回顧性研究，病例數(shù)較少，患兒及家屬可能存在回憶偏倚。

總之，由于臨床和遺傳的高度異質(zhì)性、缺乏簡(jiǎn)單而廣泛可用的輔助檢查，兒童呼吸系統(tǒng)遺傳性疾病的診斷具有挑戰(zhàn)性。臨床醫(yī)師應(yīng)不斷提高對(duì)兒童呼吸系統(tǒng)遺傳性疾病的認(rèn)識(shí)，當(dāng)對(duì)表型認(rèn)識(shí)更全面、深刻時(shí)，有針對(duì)性地選擇目標(biāo)基因測(cè)序，可減少患者花費(fèi)、降低社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。對(duì)于一些不明意義的變異，未來(lái)仍需進(jìn)行更多的功能研究。對(duì)不同變異進(jìn)行正確的功能描述有利于實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療，早期診斷、早期納入慢性肺部疾病管理并制定個(gè)體化治療方案對(duì)延緩病程進(jìn)展、改善部分患者的預(yù)后具有重要意義。