邱梅園，丁芝祥，靳 荷，蔣姣姣

0引言

視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞和脈絡(luò)膜之間的單層上皮細(xì)胞層，對(duì)視網(wǎng)膜的內(nèi)在平衡至關(guān)重要。它構(gòu)成了視網(wǎng)膜生物屏障，對(duì)神經(jīng)視網(wǎng)膜的光感受器有支持作用，此外也具有運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及免疫赦免等功能[1]。因此，RPE的異常變化會(huì)引起其功能紊亂，導(dǎo)致光感受器的退化及視力的喪失，最終導(dǎo)致增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy, PVR)或年齡相關(guān)性黃斑變性等疾病的發(fā)生。PVR是視網(wǎng)膜脫離的并發(fā)癥之一，其主要原因是由于RPE細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和纖維母細(xì)胞等的大量增殖，其中RPE細(xì)胞的增殖被認(rèn)為是PVR發(fā)生發(fā)展最主要的原因，RPE細(xì)胞異常增生使其遷移至玻璃體腔和玻璃體視網(wǎng)膜交界處，逐漸形成視網(wǎng)膜前膜，進(jìn)而牽拉視網(wǎng)膜，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離及視力損害。此外，在PVR發(fā)展之前，RPE細(xì)胞異常增殖及遷移的相關(guān)表型也難以回到正常狀態(tài)。因此，如何控制PVR的發(fā)展仍是一個(gè)難題。近年來(lái)，PVR的研究熱點(diǎn)是借助細(xì)胞凋亡途徑控制RPE細(xì)胞的增殖，或施加凋亡誘導(dǎo)劑，使增殖及遷移的細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而遏制PVR的進(jìn)展。綠茶多酚提取物表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是綠茶多酚提取物兒茶素(catechin)的主要成分，約占兒茶素的80%，具有很強(qiáng)的抗氧化能力。同時(shí)，研究表明低濃度EGCG對(duì)紫外線等因素引起的RPE細(xì)胞凋亡具有抵抗作用。而EGCG單獨(dú)使用對(duì)RPE細(xì)胞起到什么作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度EGCG作用于體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)，探討EGCG對(duì)RPE細(xì)胞的促/抗凋亡作用，并觀察其對(duì)凋亡相關(guān)因子B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(bcl-2)、BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)等因子的mRNA及蛋白水平的影響，評(píng)價(jià)EGCG對(duì)PVR早期防治的應(yīng)用價(jià)值。

1材料和方法

1.1材料EGCG(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；ARPE-19株購(gòu)買(mǎi)于武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢);青鏈霉素混合液(100×)(含青霉素10U/L，含鏈霉素10μg/L)購(gòu)自武漢博士德生物公司;DMEM培養(yǎng)基、小牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)自GIBCO公司;鼠抗β-actin單克隆抗體(上海碧云天);兔抗bcl-2、caspase-3、p53多克隆體(abcam公司)；兔抗Bax多克隆抗體(abmart)、ECL試劑盒(美國(guó)伯樂(lè)公司)。Annexin-V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)，蛋白定量分析試劑盒(上海碧云天生物有限公司)。流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD FACScan)；倒置熒光顯微鏡IX-71(日本Olympus公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)thermo公司)；冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)thermo公司)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司)，酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)。

1.2方法

1.2.1EGCG溶液配制將EGCG用PBS配制成16mg/mL的母液，0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌，用完全培養(yǎng)基稀釋成40、80、160μg/mL三個(gè)濃度。

1.2.2ARPE-19細(xì)胞株培養(yǎng)調(diào)整密度為每毫升5×104個(gè)細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基。

1.2.3hoechst33258熒光染色取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19，以每孔4×104個(gè)細(xì)胞種于6孔板內(nèi)，EGCG干預(yù)48h后，將6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，PBS洗兩遍，4%的多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗兩遍后，加入用PBS(1∶1 000)稀釋hoechst 33258，37℃孵育20min。PBS洗兩遍后，熒光顯微鏡下觀察拍照，注意操作時(shí)動(dòng)作輕柔，以免凋亡細(xì)胞被洗掉。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率EGCG處理細(xì)胞48h后，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌后離心，轉(zhuǎn)移到1.5mL EP管內(nèi)，先將10×結(jié)合緩沖液用去離子水稀釋成1×結(jié)合緩沖液，每管加100μL稀釋好的結(jié)合緩沖液，各加入5μL Annexin V-FITC和PI，室溫避光染色30min，再加入100μL稀釋好的結(jié)合緩沖液，篩網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞Bax和caspase-3及p53的mRNA表達(dá)EGCG處理細(xì)胞48h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入Trizol試劑，提取總RNA，鑒定RNA純度和濃度，按RNA試劑盒要求依次加入試劑，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，后按熒光定量擴(kuò)增試劑盒要求依次加入引物和反應(yīng)試劑，ABI7500fast熒光定量PCR儀上機(jī)檢測(cè)，反應(yīng)條件:50℃ 2min，94℃ 15min；94℃ 15s，60℃ 1min(采集熒光)，40個(gè)循環(huán)。將β-actin設(shè)為內(nèi)參，正常組設(shè)為1，以p53，Bax，caspase-3的2-ΔΔCt反映目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)收集EGCG處理48h后的細(xì)胞，PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，離心取上清，BCA方法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入bcl-2、Bax、caspase-3和p53的一抗(1∶1 000)孵育過(guò)夜，加入稀釋合適濃度的二抗，室溫孵育反應(yīng)后洗膜，膠片發(fā)光顯影后定影掃描。以β-actin作為內(nèi)參，用目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值反映蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1hoechst33258熒光染色hoechst 33258染色觀察是否有凋亡小體的出現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著EGCG濃度的升高，凋亡細(xì)胞也逐漸增多，熒光染色變高亮濃縮，并可見(jiàn)明顯的凋亡小體，見(jiàn)圖1。

圖1 hoechst 33258熒光染色分析不同濃度EGCG誘導(dǎo)ARPE-19內(nèi)的凋亡小體 箭頭所示凋亡小體。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度EGCG誘導(dǎo)ARPE-19凋亡情況不同濃度EGCG組間凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=168.409，P<0.01)，見(jiàn)表1。組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，80、160μg/mL組與對(duì)照組和40μg/mL組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，80μg/mL組與160μg/mL組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，40μg/mL組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度EGCG誘導(dǎo)ARPE-19凋亡情況 bP<0.01 vs對(duì)照組; dP<0.01 vs 40μg/mL。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同濃度EGCG凋亡相關(guān)因子的mRNA表達(dá)不同濃度EGCG處理ARPE-19后，能夠顯著上調(diào)p53，Bax和caspase-3 mRNA的表達(dá)。不同濃度EGCG各組間Bax、caspase-3、p53的mRNA表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較結(jié)果見(jiàn)表1，圖3。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同濃度EGCG凋亡相關(guān)因子的mRNA表達(dá) A:Bax;B:caspase-3;C:p53；aP<0.05, bP<0.01 vs對(duì)照組。

2.4Westernblot檢測(cè)不同濃度EGCG凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)EGCG作用ARPE-19 48h后，Western blot檢測(cè)bcl-2、Bax、caspase-3和p53的蛋白表達(dá)情況，隨著劑量的增加，EGCG可明顯抑制bcl-2的蛋白表達(dá)，而顯著增強(qiáng)Bax，caspase-3和p53的蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖4。不同濃度EGCG各組間bcl-2、Bax、caspase-3和p53的蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩兩比較結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4 Western blot檢測(cè)不同濃度EGCG凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá) A:bcl-2;B:Bax;C:caspase-3;D:p53。bP<0.01 vs對(duì)照組。

表1 各組凋亡率和各因子mRNA及蛋白表達(dá)比較

3討論

PVR是孔源性視網(wǎng)膜脫離最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，易造成視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的變形以及視網(wǎng)膜復(fù)位手術(shù)的失敗，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致視功能喪失或失明[2]。RPE細(xì)胞是PVR發(fā)生發(fā)展中公認(rèn)的最重要的細(xì)胞成分，RPE是視網(wǎng)膜10層結(jié)構(gòu)的最外層，構(gòu)成了視網(wǎng)膜的外屏障。正常情況下，RPE細(xì)胞是靜止的，但是若在受損傷的情況下可發(fā)生增殖和遷移，是PVR惡化的原因之一，因此早期抑制RPE細(xì)胞的增殖成為近年來(lái)PVR防治研究的主流趨勢(shì)和熱點(diǎn)。目前，臨床上尚沒(méi)有療效確切的藥物用于PVR的治療，各種抗增殖、抗代謝的藥物因毒性大、副作用多等問(wèn)題限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用[3-4]，目前這類(lèi)藥物尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段[5]，因此，尋求新的治療PVR的途徑提上日程，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。EGCG是綠茶多酚提取物兒茶素的主要成分，約占兒茶素的80%，具有特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)[6]。大量研究表明茶多酚具有很強(qiáng)的抗氧化能力，一直作為天然的食品抗氧化添加劑，具有抗氧化、抗腫瘤[7-8]、清除氧自由基等多種生物活性作用，有良好的應(yīng)用前景[9]。誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡能夠很好的抑制細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[10]，Cao等[11]利用50μmol/L(約23μg/mL)濃度的EGCG作用于受到紫外線處理的RPE細(xì)胞，結(jié)果表明該濃度的EGCG對(duì)紫外線引起的RPE細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，該實(shí)驗(yàn)中僅用了一個(gè)濃度。但其他濃度或更高濃度的EGCG單獨(dú)使用對(duì)RPE細(xì)胞是否具有不同的作用尚不清楚。本文利用40、80、160μg/mL的EGCG單獨(dú)作用于體外培養(yǎng)的ARPE-19[12]，檢測(cè)了細(xì)胞凋亡相關(guān)的指標(biāo)，目的是全面了解EGCG對(duì)ARPE-19的作用。

EGCG作用ARPE-19 48h，普通顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)隨著藥物溶度的增高，ARPE-19數(shù)量逐漸減少，并且變圓，乃至細(xì)胞從培養(yǎng)皿上脫落下來(lái)，為了證實(shí)細(xì)胞是壞死還是凋亡，我們利用hoechst 33258進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)使用的160μg/mL的EGCG能誘導(dǎo)ARPE-19的凋亡小體出現(xiàn)，說(shuō)明160μg/mL的EGCG能夠誘導(dǎo)ARPE-19發(fā)生凋亡，流式細(xì)胞儀進(jìn)一步分析表明，160μg/mL EGCG能夠誘導(dǎo)21%左右的ARPE-19發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生，往往伴隨著促凋亡因子表達(dá)的增多以及抑制凋亡因子表達(dá)的減少[13-15]。caspase-3、Bax和p53是屬于促凋亡細(xì)胞因子，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，常常伴隨著這些因子表達(dá)的升高[16-18]。Bcl-2細(xì)胞因子是屬于bcl-2家族的一員，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，是一種非常重要的抑制凋亡的細(xì)胞因子[16, 19]。本研究發(fā)現(xiàn)，80和160μg/mL的EGCG干預(yù)ARPE-19后，也伴隨著caspase-3、Bax、p53和Bcl-2的表達(dá)改變。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著EGCG濃度的增高，促凋亡因子caspase-3、Bax和p53的表達(dá)增多，而抑制凋亡因子bcl-2的表達(dá)減少，這說(shuō)明80和160μg/mL的EGCG在誘導(dǎo)ARPE-19發(fā)生凋亡的同時(shí)，上調(diào)caspase-3、Bax和p53的表達(dá)，下調(diào)bcl-2的表達(dá)，EGCG誘導(dǎo)ARPE-19凋亡的機(jī)制與caspase-3、Bax，p53和bcl-2等細(xì)胞因子的表達(dá)改變有關(guān)。

上述結(jié)果表明80和160μg/mL的EGCG具有促進(jìn)ARPE-19凋亡作用，有望用于抑制因RPE細(xì)胞異常增殖引起的PVR病變。但仍然有諸多問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。比如，該濃度EGCG對(duì)其他細(xì)胞，尤其是視網(wǎng)膜內(nèi)的其他細(xì)胞是否具有促凋亡作用。如果EGCG對(duì)其他細(xì)胞也具有促凋亡作用，其應(yīng)用就受到極大的限制。需要進(jìn)一步檢測(cè)恰當(dāng)?shù)臐舛?，使得該濃度EGCG只引起RPE細(xì)胞凋亡，而對(duì)其他細(xì)胞沒(méi)有影響，這樣才具有臨床應(yīng)用價(jià)值。由于EGCG是一種多靶點(diǎn)的抑制劑，其對(duì)RPE細(xì)胞的作用機(jī)制及靶點(diǎn)還遠(yuǎn)未完全闡明，這些細(xì)胞因子之間的上下游關(guān)系以及相互聯(lián)系如何尚需進(jìn)行更深入的研究。