楊開(kāi)余

563000 貴州航天醫(yī)院，貴州遵義

慢性乙型病毒性肝炎簡(jiǎn)稱乙肝，是由于乙型肝炎病毒(HBV)感染而致，臨床主要表現(xiàn)為全身乏力、惡心、嘔吐、厭食等癥狀。一旦確診需積極進(jìn)行治療，如抗病毒、抗纖維化、保肝治療等[1]。目前，臨床多采用核苷類似物治療慢性乙型病毒性肝炎患者，然而由于核苷類似物種類較多，應(yīng)用廣泛，導(dǎo)致慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，嚴(yán)重影響患者的臨床療效。基于此，本研究通過(guò)了解遵義市核苷類似物干預(yù)下慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 多聚酶區(qū)基因突變類型及發(fā)生率，以及不同核苷類似物耐藥率、突變位點(diǎn)等情況，旨在為患者的臨床治療提供更多的參考，提高患者療效，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

選取2018年12月-2019年12月在貴州航天醫(yī)院就診的102 例慢性乙型病毒性肝炎患者為研究對(duì)象，包括男56例，女46例；年齡25～76歲，平均(45.87±5.42)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②核苷酸類似物治療＞6 個(gè)月；③血清HBV DNA 出現(xiàn)病毒學(xué)突破(HBV DNA較最低值升高＞2 log10copies/mL)；③知悉本次研究并自愿參與，簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①非慢性乙型病毒性肝炎者；②合并其他腫瘤疾病、免疫性疾病者；③臨床資料缺失者；④不同意參與該研究者。

方法：①血清HBV DNA 提?。翰捎帽本┥锟萍加邢薰旧a(chǎn)的核酸提取試劑提取患者血清HBV DNA 100 μL，在血清中加入100 μL 核酸提取液A，混勻10 s，離心10 min，離心轉(zhuǎn)速12 000 r/min，之后將血清上清液抽干后加入25 μL 核酸提取液B，混勻10 s，置入100℃環(huán)境下保溫10 min，最后離心10 min，離心轉(zhuǎn)速12 000 r/min，并將上清液作為模板。②HBV 多聚酶區(qū)(P)基因突變檢測(cè)：采用序列特異性PCR 技術(shù)檢測(cè)患者HBV 多聚酶區(qū)(P)基因突變情況。根據(jù)HBV P 區(qū)基因的保守序列，采用Primer Premier 5.0 軟件包設(shè)計(jì)引物序列，引物由武漢金開(kāi)瑞生物技術(shù)公司合成，序列：a.外側(cè)正向引物ESP：5'-AGG CCT TAT AAG TTG GCG A-3'，反向引物EAP：5'-TCC TGC TCA AGG AAC CTC TA-3'；b.內(nèi)側(cè)正向引物ISP：5'-CY(T/C)T GTA TTC CCA TCC CAT C-3'；c.反向引物IAP：5'-TGA CAT ACT TTC CAA TCA ATA GG-3'。目的片段共370 bp，涵蓋了目前已知的主要HBV 核苷類抗病毒藥物耐藥突變位點(diǎn)。結(jié)果判斷：血清HBV DNA＜500 copies/mL 為陰性。PCR 反應(yīng)體系配置：第1 輪PCR 序列擴(kuò)增：10×擴(kuò)增緩沖液2.5 μL，模板DNA 2 μg，Taq DNA 聚合酶1 U，MgCl21.5 μmol/L，dNTP 2 μL，ESP、EAP 各1 μmol/L等；第2 輪PCR 序列擴(kuò)增：10×擴(kuò)增緩沖液5 μL，模板DNA 2 μg，Taq DNA 聚合酶2 U，MgCl23 μmol/L，dNTP 2 μL，ESP、EAP 各1 μmol/L、第1 輪產(chǎn)物1 μL等[2-3]。血清HBV基因型、P區(qū)基因的序列及編碼氨基酸的分析：以NCBI基因分型中23株基因型為A-H型的HBV 全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列為參照來(lái)確定基因型；采用BIOEDIT 軟件包(版本7.0.9)進(jìn)行核酸和氨基酸序列的比對(duì)，分析氨基酸的變異，用于比對(duì)的參考序列包 括A 型(M57663 和X02763)、B 型(D00331 和D00329)、C 型(AY12304l 和X75656)及D 型(X02496 和X97848)。

觀察指標(biāo)：觀察102 例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 多聚酶區(qū)基因突變類型及發(fā)生率。觀察102例慢性乙型病毒性肝炎患者核苷類似物耐藥率及其突變位點(diǎn)，主要核苷類似物包括拉米夫定、阿得福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等。

結(jié) 果

102例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 多聚酶區(qū)基因突變類型及發(fā)生率：經(jīng)檢測(cè)，102 例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 多聚酶區(qū)基因突變類型主要有單純變異、聯(lián)合變異、混合變異。共發(fā)生19 種基因突變類型，其中以單純r(jià)tM204 I 突變最多(38.24%)，其次為rtM204V/rtL180M聯(lián)合變異(27.45%)。見(jiàn)表1。

表1 102例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶區(qū)基因突變類型及發(fā)生率

102 例慢性乙型病毒性肝炎患者核苷類似物耐藥率及其突變位點(diǎn)：102 例慢性乙型病毒性肝炎患者中，拉米夫定耐藥率為59.80%(61/102)，突變位點(diǎn)主要為rtM204V、rtM204I、rtL180M 等；阿得福韋酯耐藥率為42.16%(43/102)，突變類型為單獨(dú)rtA181S、rtA181T 及聯(lián)合rtN236T 等；恩替卡韋耐藥率為22.55%(23/102)，突變類型為 rtA181V/rtQ215H、rtM204V/rtL180M+rtA181T+rtN236T 等；替比夫定耐藥率為18.63%(19/102)，突變類型為單獨(dú)rtM204I。見(jiàn)表2。

表2 102例慢性乙型病毒性肝炎患者核苷類似物耐藥率及其突變類型

討 論

臨床多采用核苷類似物治療慢性乙型病毒性肝炎，常見(jiàn)藥物如拉米夫定、阿得福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等，此類藥物具有服用簡(jiǎn)便、不良反應(yīng)低、病毒復(fù)制抑制能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因而在治療慢性乙型病毒性肝炎中應(yīng)用廣泛，且這些藥物在慢性乙型病毒性肝炎中的療效得到了肯定[4]。然而，隨著核苷類似物長(zhǎng)期使用，其可誘導(dǎo)患者的HBV 基因發(fā)生突變，耐藥性也隨之增強(qiáng)，影響了患者臨床療效。

目前，所有口服核苷類似物(包括拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋和替比夫定)在慢性乙型病毒性肝炎治療過(guò)程中均可出現(xiàn)耐藥性。細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，拉米夫定耐藥的病毒株對(duì)恩替卡韋顯型敏感性降低8～30 倍。如果乙肝病毒多聚酶本來(lái)就存在對(duì)拉米夫定耐藥的氨基酸置換(rtL180M 和/或rtLM204V/I)，再加上rtT184、rtS202 或rtM250 位點(diǎn)的置換變異，都會(huì)造成對(duì)恩替卡韋的顯型敏感性降低更多(＞70 倍)。然而，對(duì)耐藥相關(guān)的一些問(wèn)題國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有共識(shí)。有專家認(rèn)為，肝臟基礎(chǔ)好的慢性乙型病毒性肝炎患者如果抗病毒耐藥后，最好在出現(xiàn)臨床耐藥的時(shí)候換藥，因?yàn)榇藭r(shí)患者出現(xiàn)病毒反跳，酶學(xué)增高，此時(shí)換藥有利于免疫清除病毒；而對(duì)于肝硬化，尤其是失代償期肝硬化或肝移植患者最好在基因型耐藥時(shí)換藥，以免肝功能失代償。因此，對(duì)于慢性乙型病毒性肝炎患者，在出現(xiàn)耐藥后應(yīng)及時(shí)換藥或聯(lián)合治療，避免加重患者病情。

本研究通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 多聚酶區(qū)基因突變類型達(dá)19 種之多，其中以單純r(jià)tM204I 突變最多(38.24%)，其次為rtM204V/rtL180M 聯(lián)合變異(27.45%)；且在核苷類似物耐藥率及其突變位點(diǎn)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，拉米夫定(59.80%)具有極高的耐藥性，突變位點(diǎn)也較多，其次為阿得福韋酯(42.16%)、恩替卡韋(22.55%)和替比夫定(18.63%)。有研究表明，拉米夫定在治療慢性乙型病毒性肝炎中，藥物使用時(shí)間越長(zhǎng)，HBV 多聚酶區(qū)基因突變發(fā)生率越高[5]。因此，根據(jù)本次研究，在治療慢性乙型病毒性肝炎患者時(shí)，通過(guò)檢測(cè)患者HBV 多聚酶區(qū)基因突變情況，選擇合適的藥物進(jìn)行治療，更有利于提高患者的臨床療效。