楊文平 亓玉心 鄭亮 劉長江 徐淑娜 周玉法

(濟南市人民醫(yī)院 1呼吸科，山東 濟南 271100；2藥劑科)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是癌癥死亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，吸煙、飲食、環(huán)境和遺傳因素等與肺癌發(fā)生密切相關〔1，2〕。肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)，NSCLC占所有肺癌80%～85%，是最常見的肺癌類型〔3〕。NSCLC惡性程度較高，發(fā)病隱匿，57%的患者在診斷時即為晚期。目前，手術切除和化療是NSCLC最常用的臨床治療手段〔4，5〕，然而由于NSCLC轉移率較高，患者診斷時常處于中晚期已無法接受手術治療，Ⅳ期NSCLC 5年生存率不到1%〔6，7〕。雷公藤甲素(Tri)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤中提取的一種環(huán)氧二萜內酯化合物，又稱雷公藤內酯或雷公藤內酯醇。Tri具有多種生物學活性，研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗類風濕等作用，并且對老年癡呆也具有改善作用〔8，9〕。研究表明，Tri對多種癌癥如胃癌、乳腺癌、粒細胞白血病及胰腺癌等具有良好的抗腫瘤活性〔10〕，宋嵐等〔11〕報道Tri可促進NSCLC細胞系A549凋亡，然而其具體機制仍不清楚。本研究旨在探討Tri通過抑制P21活化蛋白激酶(PAK)4通路抑制NSCLC的生長和遷移。

1 材料和方法

1.1細胞培養(yǎng)與處理 NSCLC細胞系A549購自ATCC，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，CO2濃度5%。DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS)，同時添加100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素和1 mmol/L丙酮酸鈉。細胞按照加入不同濃度Tri分為4組：0.0 μg/L Tri組、0.5 μg/L Tri組、2.0 μg/L Tri組及8.0 μg/L Tri組。細胞培養(yǎng)至對數(shù)期后轉移至96孔板，在培養(yǎng)基中分別加入0.0，0.5，2.0和8.0 μg/L Tri培養(yǎng)24 h后進行相關細胞實驗。

1.2四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法 對數(shù)生長期細胞重懸浮后接種于96孔板后培養(yǎng)基中加入不同濃度Tri 37℃培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5% MTT)37℃孵育4 h，DESO溶解結晶，分光光度計檢測538 nm處吸光值。

1.3AnnexinV-FITC染色 細胞外膜上磷脂酰絲氨酸通過AnnexinV染色研究細胞凋亡。將細胞接種于6孔板后用不同濃度Tri處理48 h，根據(jù)試劑盒說明書，將細胞重懸于AnnexinV結合緩沖液中，隨后與AnnexinV-FITC共孵育15min，細胞轉移玻璃皿底部，并由CellR熒光顯微鏡記錄，以綠色細胞占細胞總數(shù)的百分比計算凋亡細胞的比例。

1.4腫瘤成球能力實驗 細胞以每孔2×103密度接種于24孔板，在添加1%甲基纖維素的DMEM-F12半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)基中添加對應濃度Tri，用相位差顯微鏡測量球體直徑，并計算球體直徑平均值。

1.5Western印跡 不同濃度Tri處理后，A549細胞以放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液裂解取全蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白。電泳結束后，將蛋白質轉移至甲醇預活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h后加入一抗室溫孵育2 h〔anti-GAPDH 1∶1 000，anti-PAK4 1∶500，anti-p絲裂原活化的細胞外信號調節(jié)激酶(MEK)1∶500，anti-p蛋白激酶(RAF)1：1500，anti-p細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)1∶500〕后4℃過夜。第2天，TBST洗滌后室溫孵育辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗1 h，電化學發(fā)光(ECL)法化學發(fā)光顯影，Quantity One 軟件分析條帶灰度值。

1.6遷移和侵襲實驗 細胞遷移實驗：細胞處理后轉移至無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。Transwell上室加入基質膠，含有10%FBS培養(yǎng)基置于下層，上室中加入細胞懸浮液。37℃培養(yǎng)24 h后4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色，隨機選擇8個視野計數(shù)。細胞侵襲實驗步驟同上但不加入基質膠。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度Tri對NSCLC活性的影響 與0.0 μg/L Tri組24、48、72 h細胞活性比較，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri組均顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度Tri對A549 細胞活性的影響

2.2Tri對NSCLC細胞凋亡和腫瘤成球能力的影響 DAPI染色結果顯示，隨著Tri處理濃度升高可見染色質固縮逐漸增多，說明凋亡細胞逐漸增多。見圖1。與0.0 μg/L Tri組細胞凋亡率比較，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri組均顯著上升，且呈劑量依賴性(均P<0.05)；與0.0 μg/L Tri組細胞成球直徑比較，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri組均顯著下降，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見圖2、表2。

圖1 不同濃度Tri對A549 細胞凋亡的影響(DAPI和Annexin V-FITC染色，×50)

圖2 不同濃度Tri對A549 細胞成球直徑的影響(×200)

表2 不同濃度 Tri 對 A549 細胞凋亡及細胞成球直徑的影響

2.3Tri對NSCLC細胞侵襲和遷移能力的影響 與0.0 μg/L Tri組細胞侵襲和遷移數(shù)比較，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri組均顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表3、圖3。

2.4PAK4信號通路在Tri抑制NSCLC中的作用 與0.0 μg/L Tri組PAK4、p-MEK、p-RAF、p-ERK比較，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri組均顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表4、圖4。

表3 不同濃度Tri對A549 細胞侵襲和遷移的影響個,n=6)

圖3 不同濃度Tri對A549 細胞侵襲和遷移的影響(結晶紫染色，×400)

表4 不同濃度Tri對A549 細胞PAK4信號通路的影響

1～4：0.0 μg/L Tri組、0.5 μg/L Tri組、2.0 μg/L Tri組、8.0 μg/L Tri組圖4 不同濃度Tri對A549 細胞PAK4信號通路的影響

3 討 論

NSCLC主要包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌，是主要的肺癌類型，65%以上NSCLC患者診斷時已處于晚期或出現(xiàn)轉移〔3，12〕。Tri是提取自傳統(tǒng)中藥雷公藤的活性成分，研究發(fā)現(xiàn)Tri具有較好的抗腫瘤活性〔13，14〕。

宋嵐等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，Tri可顯著抑制體外培養(yǎng)的A549細胞增殖并誘導其凋亡。磷脂酰絲氨酸是細胞膜的主要組分之一，在正常情況下位于細胞膜內側，當細胞壞死或凋亡時，則遷移至細胞膜外側。Annexin V是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它與磷脂酰絲氨酸具有高度結合力。FITC標記的Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞膜外側的磷脂酰絲氨酸，標記壞死或凋亡細胞〔15〕。同樣AnnexinV-FITC染色結果顯示，隨Tri處理濃度升高磷脂酰絲氨酸熒光強度逐漸升高，說明細胞凋亡逐漸增多。腫瘤細胞由于沒有接觸抑制，在體外培養(yǎng)易形成腫瘤細胞球體，可作為腫瘤細胞生長的指標。研究報道Tri可抑制肺癌細胞Spc-A1侵襲〔16〕。

宋嵐等〔11〕對Tri抑制A549增殖的研究認為，Tri通過降低Survivin和B細胞淋巴瘤(Bcl)-2表達并升高Fas表達是Tri誘導A549細胞凋亡的機制。PAK是一類進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PAK4是其中的代表性分子。PAK4被細胞外信號活化后，通過下游結合蛋白或激酶底物啟動基因轉錄并調控腫瘤生長等生物學過程〔17〕。肖琴等〔18〕報道，PAK4在 NSCLC腫瘤組織中表達明顯升高，且NSCLC患者血漿中PAK4濃度明顯升高。

綜上，Tri可通過抑制PAK4信號通路抑制NSCLC細胞增殖和轉移，并促進其凋亡。