江祖炘 汪春秀 王躍

(1宜賓市第二人民醫(yī)院 四川大學(xué)華西醫(yī)院宜賓醫(yī)院，四川 宜賓 644000；2四川省人民醫(yī)院)

隨著中國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì)，關(guān)節(jié)軟骨損傷的患者越來(lái)越多，特別是老年骨關(guān)節(jié)炎患者，關(guān)節(jié)軟骨由于解剖原因自身無(wú)血管、淋巴組織，缺乏必要的營(yíng)養(yǎng)供給，且成熟的軟骨細(xì)胞再分化增殖能力差，所以一旦損傷后自我修復(fù)困難，進(jìn)而可發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重影響日常生活〔1，2〕。近年新興的軟骨組織工程技術(shù)，提供了一種解決傳統(tǒng)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)方法取材不足、增加創(chuàng)傷、遠(yuǎn)期效果不佳等問(wèn)題的方法〔3，4〕。本研究旨在探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)復(fù)合改良纖維蛋白凝膠和軟骨細(xì)胞體外非接觸共培養(yǎng)向軟骨組織分化，獲取優(yōu)秀的種子細(xì)胞，同時(shí)可注射微創(chuàng)下修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可能方法。

1 材料與方法

1.1主要試劑及方法 清潔級(jí)3～5 d SD大鼠乳鼠4只(四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；L-DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；胎牛血清(FBS，HyClone公司)；胰蛋白酶(Trypsin，GIBCO公司)；Ⅱ型膠原酶(GIBCO公司)；兔抗大鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、cDNA 試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳試劑盒(DNA Marker)、綠如藍(lán)低毒核酸(DNAgreen)染料、凝膠加樣緩沖液均購(gòu)自天根公司。

1.2SD大鼠股骨BMSCs的獲取、培養(yǎng)、鑒定 取3～5 d SD大鼠乳鼠處死后，于超凈工作臺(tái)內(nèi)，注射器吸取0.5 ml L-DMEM培養(yǎng)基用力沖洗股骨髓腔，將沖洗液反復(fù)吹散后轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，傳代，鏡下觀察，取第3代(P3)BMSCs復(fù)合支架后行蘇木素-伊紅(HE)染色及甲苯胺藍(lán)染色。

1.3SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)、鑒定 取3～5 d SD大鼠乳鼠處死后，于超凈工作臺(tái)內(nèi)，獲取股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端關(guān)節(jié)軟骨，將剪碎的軟骨組織依次0.25%的胰蛋白酶及0.2%Ⅱ型膠原酶消化，離心后獲取軟骨細(xì)胞，將軟骨細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，傳代，鏡下觀察，取P1軟骨細(xì)胞復(fù)合支架后行Ⅱ型膠原免疫組化染色、HE染色及甲苯胺藍(lán)染色。

1.4改良纖維蛋白凝膠支架-細(xì)胞復(fù)合物制備 將P3 BMSCs加入0.9% NaCl配制的含50 mg/L的纖維蛋白原溶液，并使細(xì)胞懸液濃度為2×106/ml。再配制凝血酶復(fù)合液：凝血酶(50 μ/ml)、抑肽酶(0.2 mg/ml)、氨甲環(huán)酸(20 mg/ml)、氯化鈣(40 mmol/L)。向24孔培養(yǎng)板中每孔先加入凝血酶復(fù)合液250 μl，再加入改良的纖維蛋白細(xì)胞懸液250 μl，然后放入37℃、CO2孵箱，3～5 min后，支架凝固成型。

1.5實(shí)驗(yàn)分組 將制備的凝膠支架-細(xì)胞復(fù)合物置于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中的下室，P1軟骨細(xì)胞接種于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中的上室，BMSCs和軟骨細(xì)胞體外按細(xì)胞數(shù)比例2∶1非接觸共培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組(B組)；分別用第1代(P1)軟骨細(xì)胞和P3 BMSCs按上述方法與改良纖維蛋白膠凝膠支架材料復(fù)合，分別體外培養(yǎng)作為陽(yáng)性對(duì)照(A)組和陰性對(duì)照(C)組，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量，使3組細(xì)胞-支架復(fù)合體內(nèi)細(xì)胞總數(shù)相同。使用10%FBS 的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.6樣本采集及成軟骨組織能力檢測(cè) 標(biāo)本大體觀察及重量比較、HE和甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色。阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)蛋白聚糖(GAG)含量，RT-PCR法半定量檢測(cè)Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)檢測(cè)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs、軟骨細(xì)胞倒置相差顯微鏡觀察 原代BMSCs 48 h換液時(shí)見部分貼壁生長(zhǎng)，呈不均勻狀菌落分布，部分細(xì)胞邊緣出現(xiàn)突起，長(zhǎng)短粗細(xì)不一，可見梭形狀、少量多角形細(xì)胞，傳代生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)逐步相同，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多(圖1)。原代軟骨細(xì)胞未貼壁時(shí)呈球形，約1 d后完全貼壁，傳代后5～6 h即可見貼壁生長(zhǎng)，4 d左右即可完全長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，細(xì)胞片狀增殖，可見典型軟骨細(xì)胞“蜂巢”樣改變(圖2)。

2.23組重量比較分析 C組重量與A組、B組差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.3GAG含量測(cè)定 B組與A組GAG含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，C組GAG含量明顯低于A組和B組(P<0.05)。見表1。

圖1 原代BMSCs培養(yǎng)2 d后鏡下觀察(×40)

圖2 原代軟骨細(xì)胞4 d鏡下觀察(×40)

2.43組標(biāo)本肉眼觀察 A組和B組肉眼觀察見標(biāo)本體積較大，形態(tài)相對(duì)飽滿圓潤(rùn)，能維持凝膠支架合成時(shí)的形狀，標(biāo)本內(nèi)可見類似軟骨組織樣的膠凍狀半透明物質(zhì)沉積，韌性較好；C組標(biāo)本凝膠支架變形，部分分解，形狀不規(guī)則，韌性較差。見圖3。

2.5各組HE和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果 A組和B組標(biāo)本中皆可見軟骨細(xì)胞分布，活性良好，且可見明顯的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)繞，染色后的細(xì)胞成典型的蜂巢樣結(jié)構(gòu)，而C組標(biāo)本染色只能見到梭形的BMSCs細(xì)胞及少量的細(xì)胞外基質(zhì)。見圖4。

表1 3組標(biāo)本重量、GAG含量及Ⅱ型膠原蛋白mRNA比較

2.6標(biāo)本Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果 A組和B組標(biāo)本內(nèi)皆為典型的軟骨細(xì)胞染色后反應(yīng)，胞核為藍(lán)色，部分顏色較深，余細(xì)胞及胞外組織有均勻分布的棕色顆粒。而C組可見細(xì)胞核染色外，余未見明顯染色物質(zhì)。見圖5。

2.7標(biāo)本Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)檢測(cè) A組和B組Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，A組與B組均顯著高于C組(P<0.05)，見表1、圖6。

圖3 6 w各組肉眼觀察標(biāo)本形態(tài)

圖4 各組6 w HE染色及甲苯胺藍(lán)染色(×400)

圖5 各組6 w免疫組化染色(×400)

圖6 目的基因PCR凝膠電泳

3 討 論

關(guān)節(jié)軟骨自身解剖結(jié)構(gòu)特異及成熟軟骨細(xì)胞再分化能力差，因而關(guān)節(jié)軟骨損傷后修復(fù)是一個(gè)極其復(fù)雜且困難的過(guò)程，目前自體軟骨移植技術(shù)在修復(fù)效果上較佳，但其自體軟骨來(lái)源有限，另外傳統(tǒng)的有創(chuàng)手術(shù)如微骨折也是一種方法，但增加創(chuàng)傷的同時(shí)遠(yuǎn)期修復(fù)效果也不理想〔3，4〕。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為組織的修復(fù)再生提供了一種新的可能〔5〕，組織工程中種子細(xì)胞的選擇及體外培養(yǎng)是目前需要攻克的難點(diǎn)，也是目前研究的熱點(diǎn)。BMSCs因其取材容易，來(lái)源廣，有良好的多向分化潛能及優(yōu)秀的增殖能力使其成為組織工程中種子細(xì)胞的熱門“選手”，但存在體外定向誘導(dǎo)分化過(guò)程復(fù)雜，誘導(dǎo)生成的軟骨細(xì)胞表型不穩(wěn)定，軟骨組織質(zhì)量不佳等問(wèn)題〔6，7〕。同時(shí)自體軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增后再回植修復(fù)缺損軟骨已取得較好效果〔8〕，但其自體軟骨來(lái)源有限，限制了其進(jìn)一步的研究?；谏鲜鰡?wèn)題，本實(shí)驗(yàn)將少量的軟骨細(xì)胞與BMSCs體外共培養(yǎng)作為種子細(xì)胞，以希望優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，克服單一種子細(xì)胞來(lái)源不足、易去分化、難于精確誘導(dǎo)等缺點(diǎn)。Liu等〔9〕將BMSCs注入股骨頭壞死關(guān)節(jié)軟骨缺損的動(dòng)物模型中在軟骨缺損部位檢測(cè)到有透明軟骨形成，這可能是由于關(guān)節(jié)軟骨組織能提供BMSCs向軟骨細(xì)胞方向分化的微環(huán)境〔10〕，且骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞較正常軟骨誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化能力弱〔11〕。Acharya等〔12〕研究表明BMSCs和軟骨細(xì)胞體外非接觸共培養(yǎng)后，一定比例的軟骨細(xì)胞可分泌類似成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的細(xì)胞液，提供成軟骨誘導(dǎo)微環(huán)境，誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，并能形成類似新生軟骨組織。且軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞隔離共培養(yǎng)較混合共培養(yǎng)有更多的蛋白聚糖的積累〔13〕。至于共培養(yǎng)細(xì)胞最好比例目前無(wú)一致結(jié)論〔14〕，謝鵬等〔15〕通過(guò)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和BMSCs按1∶2比例共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)該比例能更好地表達(dá)Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白基因，能更好維持軟骨細(xì)胞表型，故本實(shí)驗(yàn)采用關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和BMSCs按1∶2比例非接觸共培養(yǎng)進(jìn)行研究。

細(xì)胞復(fù)合支架后能很好地模擬體內(nèi)軟骨細(xì)胞三維的空間分布，更有利于軟骨細(xì)胞表型的維持，有利于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌與分布〔16〕。種子細(xì)胞體外培養(yǎng)其支架的選擇也是組織工程中不可或缺的部分，所以本研究將BMSCs先與支架復(fù)合后，讓細(xì)胞分布在三維空間的支架中，再放入Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與自體軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，更好的模擬軟骨自身修復(fù)過(guò)程。黃亮節(jié)等〔17〕研究表明纖維蛋白凝膠支架內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)對(duì)于干細(xì)胞的成軟骨分化的能力是優(yōu)于Pellet培養(yǎng)體系的，可能由于纖維蛋白凝膠的三維孔隙結(jié)構(gòu)更接近于正常的軟骨組織，細(xì)胞因子之間交互更充分〔18〕，同時(shí)纖維蛋白可釋放血小板生成因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β〔19〕，進(jìn)一步促進(jìn)軟骨組織的形成。Komárek等〔20〕將組織工程軟骨以纖維蛋白凝膠固定于軟骨下骨，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，92.3%獲得了滿意效果。但一般的纖維蛋白凝膠降解時(shí)間相對(duì)較快，不能較好地匹配軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的形成速度，影響最終形成的軟骨組織。故本實(shí)驗(yàn)采用的改良纖維蛋白凝膠支架，其降解速度和新生軟骨形成速度基本匹配，從而形成的新生軟骨組織特性更接近正常軟骨組織〔21〕。同時(shí)該支架在形成階段為凝膠狀態(tài)，可以通過(guò)關(guān)節(jié)鏡微創(chuàng)技術(shù)體外注入需要行軟骨修復(fù)的地方，為微創(chuàng)治療軟骨缺損提供了新的思路。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A組和B組的標(biāo)本外觀形態(tài)維持較好，而C組隨著支架的分解不能維持較好形態(tài)，且A組和B組標(biāo)本內(nèi)可看見類似軟骨組織樣的膠凍狀半透明物質(zhì)沉積，組織學(xué)切片染色同樣顯示A組和B組標(biāo)本中皆為軟骨形態(tài)樣細(xì)胞及軟骨組織特有的陷窩樣改變，其中值得注意的是B組標(biāo)本中未見到梭形的BMSCs，可能是實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞不僅通過(guò)共培養(yǎng)后成功被誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞，原有的BMSCs全部消失〔22〕，同時(shí)也分泌了細(xì)胞外基質(zhì)維持了標(biāo)本形態(tài)。此外細(xì)胞外蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的分泌對(duì)新生軟骨組織的形成亦十分重要。陳剛等〔23〕研究表明共培養(yǎng)組的Ⅱ型膠原表達(dá)及糖胺聚糖含量均優(yōu)于對(duì)照組。本研究結(jié)果說(shuō)明BMSCs復(fù)合支架與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后能向軟骨細(xì)胞分化和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)可能誘導(dǎo)生成的軟骨細(xì)胞活性較分化成熟的軟骨細(xì)胞高。標(biāo)本Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色及RT-PCR測(cè)定Ⅱ型膠原mRNA的結(jié)果也與上述推斷吻合。

綜上，將BMSCs和少量的軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后可以作為一種更為優(yōu)秀的組織工程種子細(xì)胞，且纖維蛋白凝膠支架的可塑性，為以后可注射式微創(chuàng)軟骨修復(fù)組織工程提供可能方法。不足之處，兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的最優(yōu)比例、該方法的體內(nèi)研究及最終軟骨修復(fù)的效果還需進(jìn)一步研究。