徐梅玲 張育珠 申大年

(1青海省第五人民醫(yī)院疼痛科，青海 西寧 810000；2西寧市第一人民醫(yī)院疼痛科；3青海省第五人民醫(yī)院泌尿科)

骨質(zhì)疏松是一種常見的與年齡相關(guān)的退行性疾病，其主要特征表現(xiàn)為骨組織的顯微結(jié)構(gòu)退行性改變和骨密度降低。骨質(zhì)疏松可引起骨脆性增加，骨強度降低，易發(fā)生骨折〔1〕。骨質(zhì)疏松的核心發(fā)病機制是雌激素下降導(dǎo)致的成骨細(xì)胞骨形成能力降低和破骨細(xì)胞骨吸收增強，即骨重建和骨吸收失衡〔2〕。成骨細(xì)胞是骨形成的主要細(xì)胞，參與骨組織的代謝平衡、生長發(fā)育及損傷修復(fù)。在骨形成過程中，成骨細(xì)胞經(jīng)歷骨增殖、分化和凋亡3個階段，其增殖、分化和凋亡的異常在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔3〕。因此，研究調(diào)控成骨細(xì)胞增殖、分化和凋亡的分子機制，發(fā)現(xiàn)具有促成骨作用的藥物治療靶點，將為骨質(zhì)疏松治療提供新途徑。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類小分子非編碼RNA，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生命學(xué)過程，與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔4～6〕。有報道稱，LINC00189在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證婦女外周血單個核細(xì)胞中表達(dá)降低，可能參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過程〔7〕。但LINC00189對成骨細(xì)胞凋亡和分化的影響還未見相關(guān)報道。本研究旨在探討LINC00189對地塞米松(Dex)作用的成骨細(xì)胞凋亡和分化的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清(FBS)購自美國Hycolne公司；α-MEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；Dex購自浙江仙琚制藥股份有限公司；胰蛋白酶、p-磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/p-蛋白激酶B(Akt)信號通路抑制劑LY294002均購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司；PCR引物購自上海生工生物工程有限公司；酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3、p-PI3K、p-Akt和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自美國Santa Cruz公司；LINC00189過表達(dá)載體(pcDNA-LINC00189)和空載體(pcDNA)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 MC3T3-E1細(xì)胞用含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)箱環(huán)境：溫度37℃，5%CO2，濕度97%。及時更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時，吸棄培養(yǎng)基，適量預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞。吸棄PBS后，加入0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞，以每孔1×105個細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合至60%時，更換不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基。分別將LINC00189過表達(dá)載體(pcDNA-LINC00189)、空載體(pcDNA)轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染過程參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書。轉(zhuǎn)染6 h后，更換含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2細(xì)胞分組處理 細(xì)胞以每孔2.5×104個接種于6孔板中。未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為對照組、模型組和LY294002組。對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h；模型組細(xì)胞用含10 μmol/L〔8〕Dex的培養(yǎng)基干預(yù)24 h；LY294002組細(xì)胞用含10 μmol/L〔9〕LY294002的培養(yǎng)基預(yù)處理20 min后，再加入10 μmol/L Dex共同干預(yù)24 h。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00189的細(xì)胞用含10 μmol/L Dex的培養(yǎng)基干預(yù)24 h，記為pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LINC00189組。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LINC00189的細(xì)胞用含10 μmol/L的LY294002的培養(yǎng)基預(yù)處理20 min后，再加入10 μmol/L Dex共同干預(yù)24 h，記為LY294002+pcDNA3.1-LINC00189組。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.3實時熒光定量-PCR(RT-qPCR)檢測LINC00189、OCN和OPN的mRNA表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，核酸分析儀檢測RNA的純度和濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴增。擴增程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行35個循環(huán)。引物序列LINC00189正向引物5′-CTTTGTCGCCCAGGTTTGTT-3′，反向引物5′-AAAATTAGCCGGGTGTGGTG-3′；骨鈣素(OCN)正向引物5′-GTGGAGGGTTCATCAGCAAC-3′，反向引物5′-AGTATGTCCTTCGTCCTGCC-3′；骨橋連接素(OPN)正向引物5′-TACCCTCCCGAGTAAGTCCA-3′，反向引物5′-CTCGGCCATCATTTGTGCTT-3′；GAPDH正向引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCACA，反向引物5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算細(xì)胞中LINC00189、OCN和OPN的mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。PBS清洗細(xì)胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑和操作說明，取1.0×106個細(xì)胞，加入500 μl結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5Western印跡檢測細(xì)胞中cleaved-caspase3、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。PBS清洗細(xì)胞。放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白，100℃煮沸5 min。以每孔30 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后，將分離的蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，于5%脫脂奶粉中封閉，時間1 h。分別加入cleaved-caspase3(1∶1 000)、p-PI3K(1∶800)、p-Akt(1∶800)和GAPDH(1∶1 000)一抗，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG(1∶5 000)，37℃孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1LINC00189在Dex作用的MC3T3-E1中的表達(dá) 與對照組LINCOO189水平(0.96±0.06)比較，模型組(0.21±0.02)顯著降低(P<0.05)。與pcDNA3.1組LINC00189水平(0.21±0.02)比較，pcDNA3.1-LINC00189組(0.77±0.05)顯著升高(P<0.05)。

2.2LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1凋亡的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組和pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LINC00189組細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表1。

圖1 LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1凋亡的影響

1～4:對照組，模型組，pcDNA3.1組，pcDNA3.1-LINC00189組圖2 Western印跡檢測cleaved-caspase3蛋白表達(dá)

表1 LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1凋亡和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的影響

2.3LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1分化的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞中OCN和OPN 的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型組和pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LINC00189組細(xì)胞中OCN和OPN 的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.4LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1中PI3K/Akt的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型組和pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LINC00189組細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、表3。

表2 LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1中OCN和OPN的mRNA表達(dá)的影響

1～4：對照組，模型組，pcDNA3.1組，pcDNA3.1-LINC00189組圖3 Western印跡檢測p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)

表3 LINC00189對Dex作用的MC3T3-E1中PI3K/Akt信號通路的影響

2.5LY294002對Dex處理的MC3T3-E1凋亡的影響 與模型組比較，LY294002組細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與LY294002組比較，LY294002+pcDNA3.1-LIN-C00189組細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與pcDNA3.1-LINC00189組比較，LY294002+pcDNA3.1-LINC00189組細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖4、圖5、表4。

圖4 LY294002對Dex處理的MC3T3-E1凋亡的影響

1～4：模型組，LY294002組，pcDNA3.1-LINC00189組，LY294002+pcDNA3.1-LINC00189組圖5 Western印跡檢測cleaved-caspase3蛋白表達(dá)

表4 LY294002對Dex處理的MC3T3-E1凋亡和Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的影響

2.6LY294002對Dex處理的MC3T3-E1分化的影響 與模型組比較，LY294002組細(xì)胞中OCN和OPN 的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與LY294002組比較，LY294002+pcDNA3.1-LINC00189組細(xì)胞中OCN和OPN 的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與pcDNA3.1-LINC00189組比較，LY29 4002+pcDNA3.1-LINC00189組細(xì)胞中OCN和OPN 的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 LY294002對Dex處理的MC3T3-E1中OCN和OPN的mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

隨著我國人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松發(fā)病率逐年升高〔10〕，嚴(yán)重威脅老年人尤其是老年女性的生活質(zhì)量。成骨細(xì)胞的功能恢復(fù)和數(shù)量維持是目前骨質(zhì)疏松治療的研究重點。lncRNA長度超過200個核苷酸，在真核生物中廣泛存在。研究顯示，lncRNA在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔11〕。研究表明，下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1通過調(diào)控miR-701-3p/FGFR3軸是抑制成骨細(xì)胞增殖，并促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡〔12〕。lncRNA Rhno1過表達(dá)通過調(diào)控miR-6979-5p/BMP2軸促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，為骨折愈合提供了新的治療途徑〔13〕。

成骨細(xì)胞是參與骨形成的關(guān)鍵細(xì)胞，在骨骼發(fā)育過程中分化產(chǎn)生骨基質(zhì)，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化〔14〕。骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程中伴隨著成骨細(xì)胞的大量凋亡，骨形成減少，抑制成骨細(xì)胞的凋亡有助于促進(jìn)骨形成〔15〕。細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡過程，受多種基因的調(diào)控。caspase家族在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機制中發(fā)揮重要作用，caspase3是該家族的關(guān)鍵蛋白酶，其被激活后，裂解相應(yīng)的底物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，被稱為凋亡的執(zhí)行者〔16〕。本研究結(jié)果表明Dex通過激活caspase3介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡，過表達(dá)LINC00189可減輕Dex誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。

成骨細(xì)胞分化是介導(dǎo)骨形成和骨折愈合的重要過程。OCN和OPN是成骨的關(guān)鍵指標(biāo)，可反映成骨細(xì)胞的活性〔17〕。OPN主要存在骨組織和牙齒中，可由成骨細(xì)胞分泌，參與骨改建、吸收和礦化〔18〕。OCN是骨礦化組織中的非膠原性蛋白，可由成骨細(xì)胞合成，骨組織中OCN水平能夠直接反映骨形成和重建〔19〕。本研究結(jié)果說明Dex可抑制成骨細(xì)胞細(xì)胞分化，過表達(dá)LINC00189可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。

PI3K/Akt信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等過程〔20〕。LY294002是PI3K/Akt信號通路抑制劑，可抑制PI3K/Akt信號通路的激活。本研究結(jié)果與相關(guān)報道結(jié)果一致〔21，22〕，表明抑制PI3K/Akt信號通路可促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，抑制成骨細(xì)胞分化；過表達(dá)LINC00189通過激活細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路降低Dex誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞分化。

綜上，Dex可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，并抑制成骨細(xì)胞分化，而過表達(dá)LINC00189可有效抑制Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞分化，其可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用，提示LINC00189有望成為治療骨質(zhì)疏松的新型靶點。