姚本海 劉海軍 張霞 鄭永素 徐祖才

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

酒精中毒的患者越來(lái)越多。酒精中毒所致的心理健康和社會(huì)問題是當(dāng)前重大的世界性公共衛(wèi)生問題之一〔1〕。目前治療慢性酒精中毒的手段有限。研究顯示，丁基苯酞(NBP)抑制炎癥反應(yīng)，神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)再生等功能〔2〕。本研究基于NBP多靶點(diǎn)的作用，通過慢性酒精中毒大鼠模型的建立，觀察NBP對(duì)慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的影響及血清和海馬組織IL-12、IFN-γ和BDNF水平的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑 28只6～8周齡SD雄性大鼠(300～330 g)購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004。NBP軟膠囊(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050299)、無(wú)水乙醇(西隴科技股份有限公司，國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，批?hào)19012002)、Morris水迷宮系統(tǒng)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：JLBehv-MWMG動(dòng)物行為分析軟件)。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)試劑盒(MM-0209R1，酶免)、白細(xì)胞介素(IL)-12/P70試劑盒(MM-0140R1，酶免)、干擾素(IFN)-γ試劑盒(MM-0198R1，酶免)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及慢性酒精中毒大鼠模型建立 將28只大鼠分為正常對(duì)照組(n=6)、模型組(n=8)、NBP高劑量組(n=6)、NBP低劑量組(n=8)。除正常對(duì)照組大鼠外，其余各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，連續(xù)28 d給予大鼠6%(V/V)酒精水溶液飲用，酒精溶液每日9∶00配制，構(gòu)建慢性酒精中毒大鼠模型〔3，4〕。28 d后按NBP低劑量(10 mg/kg)和高劑量(40 mg/kg)灌胃給藥14 d，模型組正常喂養(yǎng)，對(duì)照組灌胃等劑量的玉米油(5 ml/kg)。

1.3行為學(xué)測(cè)試 14 d灌胃結(jié)束后，所有大鼠進(jìn)行連續(xù)7 d的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：用于檢測(cè)大鼠對(duì)水迷宮的學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)前一天預(yù)先將大鼠置于水迷宮中自由游泳60 s，讓其適應(yīng)水迷宮環(huán)境。在學(xué)習(xí)過程中，大鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d。每次實(shí)驗(yàn)大鼠在4個(gè)不同方向中將頭朝池壁放入水池，每天次序不同，任其游泳，直至找到平臺(tái)，并允許大鼠在平臺(tái)上停留20 s以達(dá)到強(qiáng)化記憶效果。通過攝像觀察并記錄大鼠尋找隱藏在水面下平臺(tái)的路線和逃避潛伏期(從入水到爬上平臺(tái)所需的時(shí)間)，如果大鼠在60 s內(nèi)未到達(dá)平臺(tái)，逃避潛伏期以60 s記錄，并由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺(tái)停留20 s。水迷宮周圍的標(biāo)志物固定，無(wú)聲、光、人的干擾?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：用于檢測(cè)大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后對(duì)平臺(tái)的空間位置記憶的能力。前6 d訓(xùn)練結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)第7天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺(tái)，將大鼠從原先未游過的方向放入水中，記錄大鼠在目標(biāo)象限及其他象限所花的時(shí)間。

1.4血清和海馬組織中IL-12、IFN-γ和BDNF的測(cè)定 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射10%的水合氯醛(3 ml/kg)處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心保留血清；并開顱取海馬組織。采用雙抗體夾心法測(cè)定血清和海馬區(qū)中 IL-12、IFN-γ和BDNF含量，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism7軟件，組間的顯著性差異經(jīng)one-way和two-way ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1NBP對(duì)慢性酒精中毒大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙的影響 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組大鼠隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)逃避潛伏期逐漸變短，模型組逃避潛伏期較對(duì)照組延長(zhǎng)，在第3天時(shí)差異明顯(P<0.01)；NBP低劑量和高劑量治療后縮短了大鼠的逃避潛伏期，在第3天和第4天時(shí)差異明顯(P<0.05)，見表1。提示NBP改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力是在用藥的中期階段。Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠在平臺(tái)象限停留時(shí)間〔(17.72±5.37)s〕較正常對(duì)照組〔(15.89±5.23)s〕增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NBP低劑量組〔(11.62±6.30)s〕和高劑量組〔(11.01±7.24)s〕治療后減少了平臺(tái)象限停留時(shí)間，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組潛伏期比較

2.2NBP對(duì)慢性酒精中毒大鼠血清和海馬組織中細(xì)胞因子的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組血清和海馬組織中IL-12和IFN-γ水平顯著上調(diào)(P<0.01)，BDNF水平顯著下調(diào)(P<0.01)。與模型組比較，NBP低劑量組血清IL-12水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；NBP高劑量組血清IL-12水平顯著降低(P<0.01)；NBP低劑量組和高劑量組血清和海馬IFN-γ及BDNF水平差異顯著(P<0.01，P<0.05)，見表2。說明NBP對(duì)慢性酒精中毒大鼠具有保護(hù)作用。

表2 各組血清及海馬組織IL-12、IFN-γ和BDNF含量比較

3 討 論

大量飲酒是全球發(fā)病率和死亡率的最大因素之一〔5〕。研究表明，長(zhǎng)期過量飲酒與執(zhí)行功能、記憶和元認(rèn)知能力的認(rèn)知缺陷(從輕度到重度)有關(guān)，并伴有情感過程和社交認(rèn)知的損害〔6〕。本研究表明，NBP在一定程度上可能改善慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)、記憶力能力。已有研究表明，NBP 能夠減輕慢性酒精中毒大鼠的癥狀，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，乙醇能使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放多種炎性因子如IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6等，通過促進(jìn)炎性介質(zhì)如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶(COX)-2等合成，這些炎癥物質(zhì)對(duì)大腦產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)毒性作用，從而導(dǎo)致腦功能損害〔8，9〕。本研究結(jié)果表明，NBP對(duì)慢性酒精中毒大鼠炎癥因子有抑制作用，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，對(duì)神經(jīng)功能有保護(hù)作用。研究表明，NBP可減輕氧化應(yīng)激，減弱炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)元凋亡，并改善突觸可塑性和認(rèn)知功能〔10～12〕。Climent 等〔13〕證實(shí)酒精可降低BDNF的表達(dá)，從而影響神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化及生存。研究認(rèn)為，NBP可能通過血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)BDNF的分泌，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞〔14～16〕。NBP可上調(diào)大鼠梗死區(qū)周圍和海馬區(qū)缺血腦組織中BDNF和NGF的表達(dá)，并可能通過此機(jī)制起到保護(hù)作用〔17〕。NBP治療急性腦梗死患者，可下調(diào)炎性因子的表達(dá)發(fā)揮抗炎效應(yīng)，提高BDNF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)表達(dá)，修復(fù)神經(jīng)功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔18〕。本研究Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是大鼠樣本量較少，在后期的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。