張蕊 李羿 宋麗

(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610500)

隨著年齡增長(zhǎng)，老年人的聽(tīng)覺(jué)器官開(kāi)始衰老退變，雙耳出現(xiàn)進(jìn)行性和對(duì)稱性的聽(tīng)力減退或無(wú)刺激感音，稱為老年性耳鳴耳聾〔1〕。目前，我國(guó)65歲以上老年人該病發(fā)病率高達(dá)33%～48%。并且隨著社會(huì)的老齡化，發(fā)病率正迅速上升〔2〕，因?yàn)槔夏晷远Q耳聾發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，再加上研究的起步比較晚，因此目前我國(guó)對(duì)該病的文獻(xiàn)報(bào)道較少，治療藥物也不多。中醫(yī)理論認(rèn)為老年多虛，多虛則久聾。隨著年齡增長(zhǎng)，老年人精氣衰減，致使精氣不足而難以滋養(yǎng)耳部，出現(xiàn)耳鳴耳聾。因此，老年性耳鳴耳聾的治療可以從抗衰老、補(bǔ)精氣方面入手〔3〕。例如，具有補(bǔ)腎益氣功效的六味地黃丸、耳聾左慈丸等用于治療耳鳴耳聾，療效較好。這些方劑中都含有澤瀉配伍〔4,5〕。澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale (Sam.)Juzep.的干燥塊莖〔6〕。目前澤瀉的研究重心多在其脂溶性部分，而較少關(guān)注水溶性部分〔7〕。實(shí)驗(yàn)表明，澤瀉中水溶性活性成分多糖具有顯著的抗氧化、抗衰老和提高免疫力作用〔8〕，對(duì)老年性耳鳴耳聾的治療具有一定的積極意義。本研究旨在探討澤瀉多糖對(duì)老年性耳鳴。

1 材料和方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠，SPF級(jí)，雄性，體重20 g左右，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司〔動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2013-24〕。試劑與儀器：數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；電子分析天平(YP202N，上海菁海儀器有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV752N，上海佑科儀器儀表有限公司)。澤瀉藥材(180801，四川彭山產(chǎn)，四川新荷花中藥飲片股份有限公司)，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院李羿教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale (Sam.)Juzep.的干燥塊莖。丙二醛(MDA)試劑盒(A003-1-2，南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(A001-2-1，南京建成生物工程研究所)；D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(MUST-18032905，成都曼思特生物科技有限公司)；D-半乳糖(G1804160，陜西潤(rùn)豐生物技術(shù)有限公司)。

1.2澤瀉多糖的提取純化 采用水提醇沉法〔9〕提取澤瀉中的多糖類成分，Sevag法〔10〕除去粗多糖中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。取澤瀉粉末(65目)，按料液比1∶10加入蒸餾水，于100℃下浸提3 h。抽濾，濃縮濾液。加入一定體積無(wú)水乙醇，待沉淀完全后抽濾，濾渣用無(wú)水乙醇和乙醚洗滌兩次，干燥，得澤瀉多糖粗品。粗品加水溶解后加入Sevag溶液(氯仿∶正丁醇4∶1)5 ml，以4 000 r/min離心10 min，分離上清液。揮干溶劑，干燥，即得。

1.3澤瀉多糖的含量測(cè)定

1.3.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品D-無(wú)水葡萄糖，加入一定量的蒸餾水使其溶解，配成100 mg/L對(duì)照品溶液。

1.3.2供試品溶液的制備 精密稱取1.2中制備的澤瀉多糖，加入一定量的蒸餾水使其溶解，再加1 mol/L的H2SO42 ml，加熱水解2 h，冷卻至室溫，配成100 mg/L供試品溶液。

1.3.3含量測(cè)定方法 精密量取1.3.2中制備的供試品溶液2 ml，加5%苯酚溶液1.5 ml和濃硫酸7.5 ml，混勻，靜置20 min顯色，在484 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算澤瀉多糖的含量。

1.4澤瀉多糖抗老年耳鳴耳聾的活性研究

1.4.1給藥供試品溶液的制備 稱取5 g1.2中制備的澤瀉多糖，用150 ml 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液分散。

1.4.2老年性耳鳴耳聾小鼠模型的建立 將小鼠隨機(jī)分成模型組，澤瀉多糖組(均按500 mg/kg劑量腹腔注射D-半乳糖)，空白組(腹腔注射等量生理鹽水)。每天一次，連續(xù)給藥70 d。

1.4.3給藥與取樣 按375 mg/kg劑量灌胃給予澤瀉多糖組小鼠1.4.1中制備的供試品溶液；按同等劑量灌胃給予空白組、模型組生理鹽水，每天一次，連續(xù)給藥28 d后，取小鼠腦組織和血清。

1.4.4血清中SOD值和MDA值的測(cè)定 采用試劑盒對(duì)小鼠血清中SOD值和MDA值進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5大腦組織聽(tīng)皮層病理檢測(cè) 小鼠大腦組織標(biāo)本按病理檢驗(yàn)SOP程序進(jìn)行脫水、修剪、包埋、切片、蘇木素-伊紅染色、封片等，最后鏡檢。測(cè)量聽(tīng)皮層正常神經(jīng)元及異常神經(jīng)元數(shù)量，并計(jì)算異常神經(jīng)元百分比。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1澤瀉多糖的含量測(cè)定結(jié)果 通過(guò)1.3.3中方法測(cè)定澤瀉多糖的含量分別為53.92%、56.04%、54.38%、55.80%、 53.22%、55.30%，平均含量為54.78%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.04%。

2.2血清MDA、SOD測(cè)定結(jié)果 與空白組比較，模型組血清SOD活力明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.05)；澤瀉多糖組血清SOD活力較模型組顯著增大，MDA含量顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組MDA、SOD測(cè)定結(jié)果

2.3大腦組織聽(tīng)皮層病理檢測(cè)結(jié)果 與空白組比較，模型組大腦中聽(tīng)皮層內(nèi)神經(jīng)元出現(xiàn)較明顯損害，異常神經(jīng)元數(shù)量及比例增多(P<0.05)；與模型組比較，澤瀉多糖組大腦中聽(tīng)皮層內(nèi)神經(jīng)元損害程度變化不明顯，異常神經(jīng)元數(shù)量及比例降低，不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)?？瞻捉M：大腦組織結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯的炎性滲出；聽(tīng)皮層內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊；異常神經(jīng)元小量，細(xì)胞顏色變深，體積縮小，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞核較模糊，細(xì)胞尾部偶然可見(jiàn)較為明顯的軸突樣結(jié)構(gòu)；細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管豐富，神經(jīng)纖維較均勻，膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，與神經(jīng)元相比體積較小，未見(jiàn)明顯的增生、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組：聽(tīng)皮層內(nèi)部分神經(jīng)元壞死，細(xì)胞體積縮小，排列紊亂；細(xì)胞核縮小，細(xì)胞周圍間隙變寬；細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的毛細(xì)血管、神經(jīng)纖維及膠質(zhì)細(xì)胞等無(wú)明顯增生、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。澤瀉多糖組聽(tīng)皮層內(nèi)部分神經(jīng)元壞死，細(xì)胞體積縮小，但排列較整齊；細(xì)胞核縮??；細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的毛細(xì)血管、神經(jīng)纖維及膠質(zhì)細(xì)胞等無(wú)明顯增生、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)表2和圖1。

表2 各組聽(tīng)皮層病理檢測(cè)結(jié)果

↑：壞死神經(jīng)元圖1 各組聽(tīng)皮層鏡檢結(jié)果

3 討 論

老年性耳鳴耳聾的病因復(fù)雜多樣，耳蝸螺旋器、基底膜等老化可引起感音障礙；中樞神經(jīng)、內(nèi)耳神經(jīng)等退化可引起傳導(dǎo)障礙；慢性疾病如高血壓、高脂血癥等可造成血管腔狹窄，內(nèi)耳供血不足；缺乏鋅元素可影響耳蝸功能等。目前的藥物主要是針對(duì)內(nèi)耳供血不足進(jìn)行治療，如擴(kuò)血管藥、降低血液黏稠度和溶解小血栓的藥物及B族維生素等。

本文采用注射D-半乳糖來(lái)構(gòu)建老年性耳鳴耳聾動(dòng)物模型〔11〕。因?yàn)镈-半乳糖可使機(jī)體細(xì)胞(包括聽(tīng)覺(jué)細(xì)胞)內(nèi)氧化酶的活性改變，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化等反應(yīng)，產(chǎn)生各種氧化產(chǎn)物(如MDA)，引起細(xì)胞的老化損害和功能減退，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老和聽(tīng)力障礙。SOD可幫助消除體內(nèi)的氧自由基，減少細(xì)胞的氧化損害和老化凋亡〔12〕。鏡檢時(shí)，空白組動(dòng)物大腦聽(tīng)皮層內(nèi)偶見(jiàn)少量深色神經(jīng)元，可能是由于腦組織樣本在前期處理過(guò)程中極易受到外界各種因素的影響而造成的人工假象。本研究結(jié)果說(shuō)明澤瀉多糖具有較好的清除自由基和抗自由基損害的作用，能夠較好地保護(hù)耳蝸細(xì)胞，從而對(duì)老年性耳鳴耳聾的治療具有積極意義。但光鏡下大腦組織聽(tīng)皮層神經(jīng)元損害程度和異常神經(jīng)元百分比均下降不明顯，可能是由于飼養(yǎng)過(guò)程中部分老鼠死于打斗引起的創(chuàng)傷性感染，導(dǎo)致樣本數(shù)量減少，再加上取樣的局部性，使鏡檢結(jié)果僅能代表現(xiàn)有組織切片的病理趨勢(shì)，因此后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增大給藥劑量或延長(zhǎng)給藥時(shí)間。