吳林秀 何華梅 趙應學 黃文潔 周維海 梁紅 黃敏琪 甄漢深 劉喜華

(1廣西衛(wèi)生職業(yè)技術學院，廣西 南寧 530023；2廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院；3廣西科康科技集團有限公司；4廣西中醫(yī)藥大學)

近年來隨著飲食結構變化，高尿酸血癥的患病率不斷攀升，我國社區(qū)老年高尿酸血癥總患病率已達13.1%〔1〕。高尿酸血癥是痛風的生化基礎，以尿酸升高為典型特點，尿酸濃度一旦超過生理范圍，就會引起各種病理反應，如氧化應激、線粒體功能障礙及形態(tài)絮亂、細胞凋亡、炎癥等〔2～5〕。其中，線粒體損傷是高尿酸血癥的重要機制之一。腎小管上皮細胞中有豐富的線粒體，尿酸可誘導線粒體超氧化物的生成增加，過量的活性氧(ROS)會導致線粒體損傷，受損的線粒體可誘導凋亡信號傳導，從而導致細胞的凋亡造成腎小管損傷〔6〕。目前，高尿酸血癥及腎小管損傷已成為腎臟疾病研究的重點與熱點。研究發(fā)現(xiàn)水蛭素具有緩解腎纖維化及保護腎損傷作用〔7〕，但集中于水蛭素對尿酸引起的腎小管上皮細胞氧化應激反應及細胞凋亡的作用鮮見報道。本研究通過體外構建高尿酸誘導的腎小管細胞損傷模型，探討不同濃度水蛭素對尿酸誘導腎小管損傷的修復及線粒體調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1材料和試劑 水蛭素的制備：將吸飽2%氯化鈉的金邊螞蟥活體放置在容器中，加入適量硫酸鋅和乙醇混合液，收集金邊螞蟥活體吐出的唾液(天然水蛭素提取液)，純化后加入輔料后進行冷凍干燥，獲得的粉末即天然水蛭素(質(zhì)量分數(shù)為96%，凝血酶滴定約為500 ATU/g)，蒸餾水稀釋制備含水蛭素200 ATU/g溶液，備用。主要儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國，型號：311)；移液器(Thermo，美國，型號：F3)；酶標儀(杭州奧盛儀器有限公司，中國，型號：AMR-100)；倒置熒光顯微鏡(Leica，德國，型號：DMIL LED)。線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，中國，貨號：C2006)。細胞：大鼠腎細胞NRK-52E采購自中國科學院上海細胞庫。主要試劑：尿酸、別嘌醇購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；凋亡檢測試劑盒購自BD公司；乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

1.2CCK8檢測細胞活性 收集細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，分于96孔板，5×103個細胞/孔，每孔180 μl，每種細胞每塊板接種3個同樣的孔作為復孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。以0.0、0.1、0.3、0.6、1.2 mmol/L的尿酸培養(yǎng)細胞48 h，篩選尿酸的濃度。按照6、12、24 h不同時間處理細胞，進行篩選得到水蛭素的最適干預條件為10 mmol/L處理12 h。

1.3細胞分組和處理 細胞復蘇后被分為正常組、模型組(1.2 mmol/L尿酸)、藥物干預組(1.2 mmol/L尿酸+10 mmol/L水蛭素)、陽性藥物組(1.2 mmol/L尿酸+10 mmol/L別嘌醇)。藥物干預24 h后，再以尿酸作用24 h。

1.4流式細胞術檢測ROS含量 按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)，使終濃度為10 μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為1×107/ml，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。收集各組細胞，上流式細胞儀檢測ROS。使用NovoCyte分析軟件進行分析。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 把細胞培養(yǎng)液吸出，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入胰酶細胞消化液消化。室溫孵育，吸除胰酶細胞消化液。加入收集細胞培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，400 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。加入1 ml預冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，400 r/min，4℃離心5 min，棄上清；重復洗滌3次；將細胞重懸于200 μl結合緩沖液；加入10 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和10 μl碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min；加入300 μl結合緩沖液，隨即進行流式細胞儀檢測。使用NovoExpress分析軟件進行分析。

1.6電鏡觀察細胞線粒體形態(tài) 取1×107個細胞，175 r/min離心5 min，令細胞沉于管底部，吸除上清液，立即加2 ml 2.5%戊二醛固定，固定30 min以上送檢，取適量0.1 mol/L PBS清洗3次，每次10 min。1%鋨酸固定，固定1 h，取適量0.1 mol/L PBS清洗3次，每次10 min。常規(guī)脫蠟，包埋，切片。醋酸鈾避光染色20 min，然后夾出銅網(wǎng)用雙蒸水洗3次，吸干。再用枸櫞酸鉛避光染色15 min，夾出載網(wǎng)，用雙蒸水洗去多余鉛液。透射電鏡觀察、拍照。

1.7JC-1染色檢測細胞線粒體膜電位變化 取1×106個細胞，重懸于0.5 ml細胞培養(yǎng)液中。加入0.5 ml JC-1染色工作液，輕輕吹打混勻。在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結束后，400 r/min 4℃離心3 min，沉淀細胞，棄上清。用JC-1染色緩沖液洗滌2次：加入1 ml JC-1染色緩沖液重懸細胞，400 r/min，4℃離心3 min，沉淀細胞，棄上清。重復2次。加入400 μl JC-1染色緩沖液重懸細胞，上機檢測。使用NovoCyte分析軟件進行分析。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1尿酸濃度的篩選 CCK8檢測不同濃度尿酸處理的細胞增殖率，流式檢測不同濃度的尿酸處理細胞的凋亡率，見表1。當處理濃度為1.2 mmol/L時，細胞增殖率高于60%，且凋亡率小于30%。在所測試的范圍內(nèi)，細胞的凋亡率最高，細胞增殖率最低，因此本實驗選1.2 mmol/L為適宜濃度。

表1 尿酸作用濃度篩選

2.2水蛭素抑制尿酸誘導的大鼠腎NRK-52E凋亡 流式檢測各組細胞凋亡率，見圖1。和正常組〔(6.19±0.17)%〕比較，模型組細胞凋亡率〔(31.80±1.04)%〕顯著升高(P<0.05)；和模型組比較，藥物干預組〔(21.72±1.06)%〕和陽性藥物組的凋亡率〔(20.72±1.15)%〕均顯著降低(P<0.05)。

2.3水蛭素降低尿酸誘導的大鼠腎NRK-52E的ROS水平 流式檢測各組細胞ROS水平，見圖2。和正常組〔(5.90±0.52)%〕比較，模型組細胞ROS水平〔(28.92±0.79)%〕顯著升高 (P<0.05〕；和模型組比較，藥物干預組〔(16.97±0.77)%〕和陽性藥物組的ROS水平〔(18.21±0.45)%〕均顯著降低(P<0.05)。

圖1 流式檢測各組腎NRK-52E的凋亡率

圖2 流式檢測各組NRK-52E ROS水平

2.4水蛭素緩解尿酸誘導的大鼠腎NRK-52E細胞的線粒體結構變化與膜電位下降 透射電鏡觀察各組細胞線粒體形態(tài)變化，見圖3。正常組線粒體形態(tài)完整，線粒體內(nèi)部脊和基質(zhì)完整，排列有序；模型組的細胞線粒體腫脹，內(nèi)部基質(zhì)密度減小，脊出現(xiàn)斷裂或者消失；藥物干預組和陽性藥物組以上癥狀有所緩解。JC-1染色檢測各組細胞線粒體膜電位變化，見圖4。和正常組〔(10.79±0.98)%〕比較，模型組膜電位降低的細胞比例〔(41.22±2.37)%〕顯著增多(P<0.05〕；和模型組比較，藥物干預組〔(20.54±0.93)%〕和陽性藥物組的膜電位下降的細胞比例〔(21.92±0.45)%〕顯著減少(P<0.05)。

圖3 電鏡觀察大鼠腎NRK-52E細胞線粒體形態(tài)(×8 000)

圖4 JC-1染色檢測大鼠腎NRK-52E細胞線粒體膜電位變化

3 討 論

尿酸是微溶于水的晶體結構的陰離子有機酸，是嘌呤類物質(zhì)在人體內(nèi)經(jīng)黃嘌呤氧化酶(XOD)作用代謝的終產(chǎn)物〔8〕。人體內(nèi)70%的尿酸從腎臟排泄，要經(jīng)歷腎小管的重吸收和再分泌過程。最后只有約10%的尿酸由腎小球濾過并排出體外。尿酸在體內(nèi)的生成與代謝平衡被破壞，尿酸蓄積會導致高尿酸血癥，從而引發(fā)腎損傷〔9，10〕。金邊螞蟥，壯藥稱之堵平懷，為醫(yī)蛭科動物菲牛蛭的干燥全體。作為一種珍貴的廣西壯藥，在民間常用于痛風病癥的治療，療效確切，被廣大患者所接受。前期研究發(fā)現(xiàn)，金邊螞蟥能顯著降低高尿酸血癥小鼠血液尿酸水平和正常小鼠尿酸水平，且毒性低使用安全〔11〕。進一步研究發(fā)現(xiàn)，金邊螞蟥活性物質(zhì)水蛭素可降低高尿酸血癥小鼠血清中的尿酸水平，同時，還可降低由氧嗪酸鉀引起的慢性高尿酸小鼠血清高尿酸水平，降低血清尿酸氮水平，改善模型小鼠的腎臟病理學改變〔12，13〕。綜合上述實驗，本研究進一步探索水蛭素對尿酸引起的腎損傷的作用。

氧化反應本是維持正常機體代謝所必須的生理過程。ROS是由氧激發(fā)的化學性質(zhì)十分活潑的分子，是誘發(fā)氧化應激的重要因素〔14～16〕。在正常情況下，人體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，當機體受到某些因素刺激處于應激狀態(tài)時，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，細胞內(nèi)ROS升高超過其清除能力，在體內(nèi)蓄積引起細胞氧化應激〔17〕。鄧蓉等〔18〕研究表明，尿酸能提高NRK-52E中ROS含量，導致細胞氧化及抗氧化系統(tǒng)失衡。本研究結果提示水蛭素提高了細胞的抗氧化能力，緩解氧化應激反應。

線粒體是真核生物中重要的細胞器，通過氧化呼吸作用為細胞生命活動提供所需要的能量。線粒體在氧化應激中起著重要作用，線粒體既是氧化應激的重要來源，又是氧化應激的靶向細胞器〔19，20〕。氧化應激能夠造成線粒體本身結構的變化，使線粒體功能障礙，三磷酸腺苷(ATP)合成阻滯，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔道開放，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位崩潰，進而促進線粒體釋放凋亡誘導因子，最終導致細胞凋亡〔21，22〕。本研究從水蛭素對線粒體損傷的影響進一步探索水蛭素通過增強細胞抗氧化能力保護NRK-52E的作用機制。本研究結果說明模型組細胞中ROS的上升，造成了線粒體的損傷，從而激活線粒體細胞凋亡途徑，誘導細胞凋亡，而水蛭素預處理后的細胞ROS水平降低，線粒體結構紊亂程度有所改善，膜電位下降的細胞減少。