單海軍 婁元俊 朱珊 介小素 侯玉晉 張英英 史華 雷震 曹彩紅

(河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)，河南 鄭州 450002)

腦癱是指由于各種因素導(dǎo)致腦部非進(jìn)行性損傷，其中痙攣型腦癱(SCP)占腦癱總發(fā)病例數(shù)的60%～70%〔1〕。SCP多以四肢運(yùn)動障礙及姿勢異常為主要表現(xiàn)，死亡率、致殘率高〔2〕。目前國內(nèi)外仍無治療SCP的特效藥物，主要以長期康復(fù)訓(xùn)練為主〔3〕。SCP中醫(yī)治療以補(bǔ)腎、開竅、祛痰為主，通過經(jīng)絡(luò)傳導(dǎo)將臟腑調(diào)理與腦部康復(fù)相連，發(fā)揮治療作用〔4〕。補(bǔ)腎開竅祛痰方具有益氣活血、補(bǔ)肝益腎、調(diào)和陰陽的功效，可通過調(diào)理臟腑功能促進(jìn)腦病康復(fù)〔5〕。但補(bǔ)腎開竅祛痰方是否能改善SCP的運(yùn)動行為學(xué)狀態(tài)及其可能的作用機(jī)制尚不明確，仍需深入探討。鑒于此，本研究通過觀察補(bǔ)腎開竅祛痰方對缺氧缺血后SCP大鼠運(yùn)動行為的改善效果，初步探討其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar大鼠，56只，4周齡，雌雄各半，體重110～180 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2017-0001。

1.1.2藥物、主要試劑和儀器 補(bǔ)腎開竅祛痰方中藥材(中國藥材公司北京市公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD，南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號20180106、20180906)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司，生產(chǎn)批號AJ60783A)，二喹啉甲酸蛋白定量分析試劑盒(美國熱電公司，生產(chǎn)批號180918)，兔抗大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax，美國Abcam公司，生產(chǎn)批號GR5099-42、GR3239757-12、GR3275117-3)。CY-12C便攜式測氧儀(杭州艾普設(shè)備儀器有限公司)，BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，F(xiàn)inesse325型石蠟切片機(jī)(英國 Thermo Shando 公司)，BH-2型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，CCD/CMOS型圖像采集(日本尼康顯微照像系統(tǒng))，A1300型活體肌張力檢測系統(tǒng)(加拿大Aurora公司)，3550UV型酶標(biāo)儀、7500型實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀、i12型電泳儀、CheniDoc XRS型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立及分組 選取56只Wistar大鼠，其中46只采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法建立SCP大鼠模型〔6〕：采用腹腔注射4%水合氯醛麻醉后，大鼠仰臥位固定，頸部備皮，做頸正中切口，沿氣管兩側(cè)分離雙側(cè)頸總動脈，穿線備用，提起穿線，用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，夾閉20 min后取下微動脈夾再灌注10 min，然后重新夾閉再灌注2次，最后抽去穿線，縫合切口，腹腔注射青霉素鈉抗感染。改良Tarlov分級出現(xiàn)3級及以下癱瘓、Ashworth痙攣量表評估肌張力達(dá)到1級及以上則判定為SCP大鼠模型建立成功〔7〕，將建模成功大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、低、中、高劑量組；其余10只大鼠僅在雙側(cè)頸總動脈穿線，不做夾閉再灌注處理，其余操作同前，將其設(shè)為正常組。

1.2.2術(shù)后干預(yù) 補(bǔ)腎開竅祛痰方組方：醋龜甲10 g、鹿角膠10 g、熟地黃20 g、紫河車3 g、菟絲子10 g、益智仁30 g、石菖蒲6 g、制遠(yuǎn)志6 g、全蝎3 g、五味子12 g、黃芪12 g，以上中藥按《中藥學(xué)》煎煮標(biāo)準(zhǔn)制作，最終水制劑中每毫升相當(dāng)于生藥1.85 g，人臨床用藥方法為：每劑分2次分別煎煮至150 ml混勻，早晚分服，300 ml中藥湯汁約含生藥9.6 g。按照體重?fù)Q算方法：大鼠臨床等效劑量為9.6/60×6.25=1.0 g/kg，低、中、高劑量組用藥劑量分別為大鼠臨床等效劑量的0.5倍、1.0倍、2.0倍。術(shù)后第2天開始分別按生藥0.5、1.0、2.0 g/kg體重灌胃給藥，正常組、模型組同時灌胃生理鹽水3 ml/只，1次/d，持續(xù)灌胃28 d。

1.2.3行為學(xué)評估 末次灌胃后，進(jìn)行運(yùn)動行為學(xué)檢查及評分〔8〕，斜坡試驗(yàn)：將大鼠頭部朝下置于傾斜角為45°的斜坡上，記錄旋轉(zhuǎn)至頭部向上轉(zhuǎn)過135°的時間；平衡木試驗(yàn)：將80×2.5 cm平衡木懸放于距臺面10 cm處，記錄大鼠爬行過程中后肢從平衡木上滑脫的次數(shù)；曠野試驗(yàn)：將大鼠放于60×60×60 cm不透光木箱中，底部被均分為9個方格，攝像機(jī)記錄第1 min內(nèi)穿越方格數(shù)(身體穿越1方格一半以上為1格)。

1.2.4腦白質(zhì)內(nèi)MDA、SOD水平檢測 末次灌胃后，10%水合氯醛麻醉大鼠，即刻開胸腔無菌生理鹽水灌注心臟至無血液排除，冰凍手術(shù)臺迅速取腦組織，嗅球端取腦室周圍白質(zhì)(胼胝體、深層腦白質(zhì)和部分外囊)，稱重后按照1∶9加入預(yù)冷生理鹽水，制作組織勻漿液，3 500 r/min離心10 min后取上清液，檢測腦白質(zhì)內(nèi)MDA、SOD含量。

1.2.5腦白質(zhì)內(nèi)Bcl-2、Bax、BDNF mRNA相對表達(dá)量檢測 取大鼠腦白質(zhì)約75 mg，剪碎后，采用Trizol法提取總核糖核酸(RNA)。用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將獲得互補(bǔ)鏈脫氧核糖核酸(cDNA)，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，嚴(yán)格按照PCR試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系25 μl：SYBR Premix Ex Taq 11.5 μl，5 μmol/L上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 10.5 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；94℃變性15 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，重復(fù)35個循環(huán)。以β-actin為管家基因，2-△△Ct為目的基因的相對表達(dá)強(qiáng)度。Bcl-2：上游：5′-CGTAGCTGATCGTACGTGATCGT-3′，下游：5′-GTAGCTAGCTAGCTAG CTAG CTC-3′；Bax：上游：5′-ATGCTGTATCGTGTAGCTACTGA-3′，下游：5′-GTAGCTGATCGTACGTGCTATCG-3′；BDNF：上游：5′-GTACGTATCGTACGTAGCTC GTC-3′，下游：5′-GTCATCGTAGCTAGCTGCTATCT-3′；β-actin：上游：5′-GTACGTAGCTAGCT AGCTGATCG-3′，下游：5′-CGTAGTCGTACGTAGCTGCTTAA-3′。

1.2.6腦白質(zhì)內(nèi)Bcl-2、Bax、BDNF蛋白相對表達(dá)量檢測 取大鼠腦白質(zhì)約75 mg，液氮中研磨后轉(zhuǎn)至離心管，加入細(xì)胞裂解液，置于100℃水浴中10 min，12 000 r/min離心10 min后取上清液，二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg樣品加入等體積上樣緩沖液混勻后，100℃水浴加熱3 min，再次離心取上清液，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜45 min，加入封閉液搖床室溫孵育2 h，加入封閉液稀釋一抗(1∶1 000)，4℃搖床孵育過夜，洗滌后加入封閉液稀釋二抗(1∶10 000)，常溫孵育60 min，暗室中顯影。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描并用灰度值軟件分析，以Bcl-2、Bax、BDNF與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況觀察 正常組10只全部存活，其余46只建模期間死亡5只，均發(fā)生在術(shù)后24 h內(nèi)，1只建模失敗剔除，建模成功率86.96%，大鼠術(shù)后均出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、反應(yīng)遲鈍、采食量下降；正常組術(shù)后12 h開始精神及四肢逐漸恢復(fù)，反應(yīng)正常、采食量逐漸正常。

2.2運(yùn)動行為學(xué)對比 模型組與正常組相比斜坡試驗(yàn)時間較長、平衡木試驗(yàn)后肢滑脫次數(shù)較多、曠野試驗(yàn)第1分鐘穿過方格數(shù)較少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3個劑量組與模型組相比，斜坡試驗(yàn)時間較短、平衡木試驗(yàn)后肢滑脫次數(shù)較少、曠野試驗(yàn)第1分鐘穿過方格數(shù)較多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3個劑量組作用呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

2.3腦白質(zhì)內(nèi)MDA、SOD水平對比 模型組與正常組相比，腦白質(zhì)內(nèi)MDA水平較高、SOD水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3個劑量組與模型組相比，腦白質(zhì)內(nèi)MDA水平較低、SOD水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3個劑量組作用呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 運(yùn)動行為學(xué)及腦白質(zhì)內(nèi)MDA、SOD水平比較

2.4腦白質(zhì)內(nèi)Bcl-2、Bax、BDNF mRNA相對表達(dá)量對比 模型組與正常組相比，腦白質(zhì)內(nèi)Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量較低、Bax mRNA相對表達(dá)量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3個劑量組與模型組相比，Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量較高，Bax、BDNF mRNA相對表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3個劑量組作用呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

2.5腦白質(zhì)內(nèi)Bcl-2、Bax、BDNF蛋白相對表達(dá)量對比 模型組與正常組相比，腦白質(zhì)內(nèi)Bcl-2蛋白相對表達(dá)量較低，Bax、BDNF蛋白相對表達(dá)量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3個劑量組與模型組相比，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量較高、Bax、BDNF蛋白相對表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3個劑量組作用呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 腦白質(zhì)內(nèi)Bcl-2、Bax、BDNF mRNA及蛋白表達(dá)量對比

圖1 Western印跡檢測蛋白表達(dá)

3 討 論

SCP的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，由于多種因素如圍生期缺血缺氧引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，進(jìn)而造成高位中樞對脊髓牽張反射的調(diào)控異常，影響運(yùn)動行為〔9〕。腦部缺血缺氧可引起循環(huán)血量下降、能量代謝及鈣平衡紊亂等原發(fā)性腦組織損傷，且缺血后再灌注可引起繼發(fā)性損傷，加重腦組織尤其是腦白質(zhì)的損傷〔10〕。中醫(yī)理論認(rèn)為，頭部經(jīng)絡(luò)密集為諸陽之會，經(jīng)絡(luò)可通過表里相配關(guān)系將之與臟腑、五官相連，因此可通過調(diào)理臟腑、疏通經(jīng)絡(luò)而達(dá)到治療腦部疾病的效果〔11〕。

本研究結(jié)果提示補(bǔ)腎開竅祛痰方可顯著改善缺氧缺血后SCP大鼠運(yùn)動行為，且其作用呈劑量依賴性。本研究采用雙側(cè)頸動總動脈結(jié)扎法建立SCP模型，與既往王震〔12〕的報(bào)道相符，提示本研究造模大鼠具備SCP上運(yùn)動神經(jīng)元病理損傷特點(diǎn)，滿足實(shí)驗(yàn)要求。補(bǔ)腎開竅祛痰方由醋龜甲、黃芪、熟地黃、紫河車、石菖蒲等11味中藥組成，是由孔圣枕中丹加減而成。方中黃芪、熟地黃為均君藥，歸肝腎經(jīng)，黃芪益氣升陽，熟地黃益精填髓；石菖蒲、紫河車、益智仁、五味子為臣藥，歸心脾胃經(jīng)，石菖蒲祛痰開竅、化濕溫胃，紫河車益氣養(yǎng)血、滋補(bǔ)腎精，益智仁溫脾和胃、固精補(bǔ)腎，五味子益氣生津、補(bǔ)腎凝心；醋龜甲、鹿角膠、菟絲子、全蝎為佐使藥，歸肝腎心經(jīng)，醋龜甲滋陰潛陽，鹿角膠益腎健骨，菟絲子滋陰補(bǔ)腎，全蝎通絡(luò)止痙〔13〕。諸味中藥合用，相輔相成，共奏益氣活血、補(bǔ)肝益腎、調(diào)和陰陽、祛毒化濁之功效。補(bǔ)腎開竅祛痰方應(yīng)用于缺氧缺血后SCP之治療，充分體現(xiàn)治病求本、陰陽相濟(jì)、益氣與補(bǔ)腎并重的配伍技巧，君臣佐使相互配合，可直達(dá)病所，改善運(yùn)動行為事半功倍。

本研究結(jié)果提示補(bǔ)腎開竅祛痰方對缺氧缺血后SCP大鼠腦白質(zhì)損傷的減輕作用可能與上調(diào)Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax、BDNF mRNA和蛋白表達(dá)、調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax信號通路有關(guān)，且其作用在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。本研究結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈進(jìn)行SCP造模，可造成大鼠腦組織缺氧、缺血，恢復(fù)再灌注后，進(jìn)一步引發(fā)腦組織缺血再灌注損傷，激活腦細(xì)胞凋亡系統(tǒng)。SOD是機(jī)體中重要的抗氧化酶，腦組織缺血缺氧后再灌注可引起氧自由基大量生成，MDA是其主要代謝產(chǎn)物，過量的MDA可加速神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)異常，加重腦組織損傷程度〔14,15〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)〔16〕，黃芪不僅具有改善微循環(huán)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種功效，而且可改善細(xì)胞生理代謝，增強(qiáng)抗缺氧能力及清除自由基能力。Bcl-2是典型凋亡抑制基因，而Bax是Bcl-2的抑制因子，可競爭性結(jié)合效應(yīng)分子，發(fā)揮促凋亡作用〔17〕。腦白質(zhì)缺血應(yīng)激及再灌注應(yīng)激損傷后，細(xì)胞內(nèi)自由基含量升高，進(jìn)而激活Bax基因，啟動線粒體膜電位途徑激活凋亡程序信號，導(dǎo)致細(xì)胞過度凋亡而損傷。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)家族重要成員，在腦組織中分布廣泛。研究發(fā)現(xiàn)〔18〕，BDNF可通過反饋調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax信號通路，而減少腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到改善神經(jīng)功能的作用，且BNDF可為腦白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元提供營養(yǎng)環(huán)境，提高其存活率。研究發(fā)現(xiàn)〔19～21〕，致遠(yuǎn)散可有效緩解東莨菪堿對腦記憶功能的損害；石菖蒲水提取物可有效抑制N-甲基-D-天門冬氨酸受體與相應(yīng)配體結(jié)合，發(fā)揮抗驚厥、抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡作用；熟地黃可有效縮短衰老大鼠Morris水迷宮平臺潛伏期，增強(qiáng)其學(xué)習(xí)記憶功能。本研究應(yīng)用不同劑量補(bǔ)腎開竅祛痰方對缺氧缺血后SCP大鼠干預(yù)后，一方面增強(qiáng)細(xì)胞抗缺氧及清除氧自由基能力，改善腦組織微循環(huán)系統(tǒng)，另一方面通過抑制Bcl-2/Bax凋亡信號通路、上調(diào)BNDF mRNA和蛋白的表達(dá)，減輕缺氧缺血腦白質(zhì)損傷，改善大鼠運(yùn)動能力。