趙冀安 張梅 張蕊 董梁 聶文佳 劉文聰 劉維麗

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 1普通外科，河北 石家莊 050013；2感染性疾病科；3消化內(nèi)科；4醫(yī)務(wù)處；5超聲科；6肝膽外科)

膽管癌惡性程度高、發(fā)病隱匿、診治困難，所以發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。外科根治性切除為膽管癌治療首選，其對(duì)放化療均不敏感，所以預(yù)后較差，遠(yuǎn)期治療效果欠佳〔1〕。尋找有效抑制膽管癌細(xì)胞增殖侵襲的方法，是目前困擾臨床醫(yī)生的主要問(wèn)題。姜黃素(CUR)是姜黃的有效成分，在臨床實(shí)驗(yàn)中對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等癌癥有很強(qiáng)的抗腫瘤作用〔2〕。但是臨床研究顯示由于其生理?xiàng)l件下的不穩(wěn)定性，使其出現(xiàn)了較差的生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)特征，從而限制了它在抗癌治療方面的應(yīng)用〔3,4〕。溴苯基CUR(GL63)是CUR的一種衍生物，具有明顯的水溶性和穩(wěn)定性，且具有較高的細(xì)胞通透性、生物利用度和抗腫瘤活性〔5〕。Wang等〔6〕表明與CUR相比，GL63能更有效地抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)3磷酸化，下調(diào)STAT3下游靶點(diǎn)陣列，從而抑制細(xì)胞增殖、集落形成、細(xì)胞遷移和侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究選用人膽管癌RBE細(xì)胞和BALB/C-nu雌性裸鼠制造移植瘤動(dòng)物模型，研究GL63對(duì)細(xì)胞和移植瘤的抑制作用，并研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 GL63由河北科技大學(xué)劉守信教授合成并提供。人膽管癌RBE細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。BALB/C-nu雌性裸鼠，6周齡，體重16～18 g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，并在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，磷酸化酪氨酸激酶(p-JAK)2、磷酸化(p)-STAT3、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-2和β-actin兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2RBE細(xì)胞的培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基對(duì)人膽管癌RBE進(jìn)行培養(yǎng)，置于含5% CO2的37℃的培養(yǎng)箱中。當(dāng)培養(yǎng)瓶底部貼壁細(xì)胞達(dá)90%以上時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)行細(xì)胞集落分析，將1 000個(gè)細(xì)胞/孔分3次接種在6孔板中，并在37℃和5% CO2的加濕室內(nèi)培養(yǎng)2 w。RBE細(xì)胞集落用1%結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)。

1.3噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)RBE細(xì)胞增殖抑制率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RBE細(xì)胞培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)基，各組分別加入含1%二甲基亞礬的不同濃度GL63(0、10、20 μmol/L)。分別培養(yǎng)8 h、12 h和24 h后，每孔加入20 μl的5 mg/ml MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取上清液后，每孔加入150 μl二甲基亞砜，低速搖床震蕩10 min后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)儀檢測(cè)570 nm每孔的吸光度(OD)值。抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RBE細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的GL63處理(0、10、20 μmol/L)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集、洗滌細(xì)胞，先加膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V)5 μl，再加丙酸碘10 μl混勻，避光反應(yīng)20 min后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。

1.5移植瘤模型建立和分組 收集乙二胺四乙酸(EDTA)消化的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人膽管癌RBE細(xì)胞，將其配制成濃度為1×107個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，接種到裸鼠背部皮下，接種后觀察。待裸鼠皮下腫瘤直徑增至5～6 mm時(shí)認(rèn)為成瘤，按照每組10只隨機(jī)分對(duì)照組和低、高濃度GL63組，各組裸鼠瘤體大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低、高濃度GL63組裸鼠腹腔分別注射10、20 μmol/L GL63溶液0.2 ml，對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水。給藥3次/w，共4 w。用藥后每隔4 d測(cè)量腫瘤體積，腫瘤體積=1/2長(zhǎng)徑×短徑2，4 w后處死各組裸鼠，完整剝?nèi)∧[瘤，對(duì)裸鼠身體重量和腫瘤重量進(jìn)行測(cè)量，抑瘤率=(對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100%。

1.6病理組織學(xué)檢測(cè) 10%甲醛固定腫瘤組織，制備成4 μm厚度連續(xù)石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟、水化、抗原微波修復(fù)，山羊血清封閉，滴加細(xì)胞增殖抗原(PCNA，1∶100)4℃冰箱過(guò)夜。滴加鏈霉素蛋白-過(guò)氧化氫酶溶液標(biāo)記二抗，孵育后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，二氨基聯(lián)基膠(DAB)顯色。每次染色設(shè)同步陽(yáng)性和陰性對(duì)照。光鏡下觀察、攝片，隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察陽(yáng)性細(xì)胞。PCNA蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色。無(wú)著色為0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞比例：染色比例小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，大于50%為3分。2項(xiàng)相加為最后判斷結(jié)果：兩者分?jǐn)?shù)之和最大值為6，0～2分陰性表達(dá)，>2分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.7Western印跡 切取腫瘤組織碾碎低溫超聲勻漿，加入蛋白質(zhì)提取液裂解，高速離心后收集上清液，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。再用5%脫脂牛奶封閉，隨后加入1∶1 000的兔抗人p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9、TIMP-2和β-actin多克隆抗體4℃過(guò)夜。而后用TBST清洗后再分別加入1∶5 000標(biāo)記的山羊抗兔抗體，室溫孵育后經(jīng)電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)，用圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組不同時(shí)間點(diǎn)RBE細(xì)胞增殖抑制率比較 RBE細(xì)胞的增殖和克隆形成隨GL63濃度增加而下降。RBE細(xì)胞形態(tài)和增殖率在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度GL63在不同時(shí)間點(diǎn)作用于RBE細(xì)胞，抑制率逐漸升高，細(xì)胞增殖率逐漸降低。表明GL63可顯著抑制RBE細(xì)胞增殖，其增殖抑制率呈濃度和時(shí)間依賴關(guān)系(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)抑制率比較

圖1 各組RBE細(xì)胞集落形成

2.2各組RBE細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期比較 與對(duì)照組〔(1.32±0.30)%〕相比，低、高濃度GL63組凋亡率〔(28.42±4.40)%、(64.55±6.60)%〕顯著升高，且呈濃度依賴性(均P<0.05)，高濃度GL63組細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用最為明顯；G0/G1期細(xì)胞比例隨GL63濃度增加而升高。對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例〔(34.58±1.09)%〕、明顯低于低、高濃度GL63組〔(51.26±0.45)%、(68.69±0.85)%；均P<0.05〕。表明GL63阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)各組RBE細(xì)胞凋亡率

圖3 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)各組RBE細(xì)胞周期

2.3各組裸鼠體重、瘤重、瘤體積的抑瘤率比較 實(shí)驗(yàn)期間各組裸鼠均未出現(xiàn)死亡，3組裸鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)；與對(duì)照組比較，低、高濃度GL63組瘤重和瘤體積明顯低，抑瘤率明顯高，且高濃度組瘤重和瘤體積更低，抑瘤率更高(均P<0.05)，見(jiàn)表2。說(shuō)明GL63對(duì)裸鼠RBE移植瘤增長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

表2 治療后各組裸鼠體重、瘤重、瘤體積和抑瘤率的比較

2.4各組移植瘤組織病理形態(tài) 對(duì)照組腫瘤細(xì)胞形態(tài)較大，呈巢、片狀排列，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯，病理性核分裂多見(jiàn)。腫瘤周圍可見(jiàn)血管和淋巴管。而低、高濃度GL63組細(xì)胞與對(duì)照組相比，分化程度較高，未發(fā)現(xiàn)明顯淋巴管侵犯和血管內(nèi)瘤栓形成，見(jiàn)圖4。提示GL63能影響裸鼠移植瘤增殖分化。PCNA蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核，呈棕褐色顆粒狀，染色較深。對(duì)照組大部分移植瘤細(xì)胞PCNA表達(dá)陽(yáng)性，而低、高濃度GL63組移植瘤細(xì)胞PCNA表達(dá)(48.5±4.1、72.3±6.4)顯著低于對(duì)照組(115.2±8.3)，且高濃度GL63組腫瘤細(xì)胞PCNA表達(dá)量明顯低于低濃度GL63組(均P<0.05)，見(jiàn)圖5。說(shuō)明GL63能夠抑制膽管癌細(xì)胞的增殖。

2.5Western印跡檢測(cè)各組移植瘤組織相關(guān)基因表達(dá) 與對(duì)照組比較，低、高濃度GL63組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著下降，而B(niǎo)ax和TIMP-2蛋白表達(dá)顯著增高，且呈濃度依賴性(均P<0.05)，見(jiàn)表3、圖6。

圖4 各組移植瘤光鏡下形態(tài)(HE染色，×400)

圖5 免疫組化檢測(cè)各組移植瘤PCNA蛋白表達(dá)(PCNA染色，×400)

表3 各組移植瘤組織相關(guān)基因表達(dá)比較

1～3：對(duì)照組、低濃度GL63組、高濃度GL63組圖6 Western印跡檢測(cè)各組移植瘤組織相關(guān)基因表達(dá)

3 討 論

膽管癌是來(lái)源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，但由于其起病隱匿，大多數(shù)患者診斷為該疾病時(shí)已到中晚期，往往失去根治性切除機(jī)會(huì)，而目前的化療藥效果不佳，所以該疾病預(yù)后極差。因此尋找高效低毒的抗腫瘤藥物對(duì)治療膽管癌和提高患者生存期具有重要意義。國(guó)內(nèi)多個(gè)研究初步顯示CUR及其衍生物尤其是GL63具有廣泛的抗腫瘤活性。Xiao等〔7〕實(shí)驗(yàn)證明GL63和CUR對(duì)正常肝細(xì)胞未發(fā)生誘導(dǎo)凋亡現(xiàn)象，說(shuō)明GL63無(wú)明顯毒性。本研究在體外和體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中首次證實(shí)GL63能抑制膽管癌RBE細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其發(fā)生凋亡，且細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。

本研究中GL63抑制了STAT3磷酸化，使STAT3無(wú)法再二聚體化，進(jìn)而抑制STAT3進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，使其調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)能力下降，從而促進(jìn)了膽管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)果說(shuō)明GL63在裸鼠體內(nèi)有效地抑制了JAK2/STAT3信號(hào)通路，通過(guò)減少STAT3及其下游抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡來(lái)抑制腫瘤的增長(zhǎng)。

JAK2/STAT3信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡、分化和免疫功能等多種生理過(guò)程中起發(fā)揮重要作用，當(dāng)發(fā)生異常活化時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖甚至惡變〔8,9〕。磷酸化的STAT3通過(guò)與基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合來(lái)充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子，以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡、血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移〔10〕，如胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸癌、乳腺癌和其他癌癥，包括膽管癌〔11〕。STAT3調(diào)控下游靶基因包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL、生存蛋白(survivin)和促凋亡蛋白Bax、Bcl-2同源拮抗劑(Bak)〔12,13〕，所以抑制STAT3的活化即可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡〔14〕。阻斷JAK2/STAT3通路成為治療惡性腫瘤的方向之一。有研究表明GL63通過(guò)調(diào)控STAT3下游靶點(diǎn)，抑制人肝癌細(xì)胞HepG2和鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖，主要是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和隨后的細(xì)胞凋亡，減少Bcl-2蛋白表達(dá)，而促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)增高〔7,15〕。

轉(zhuǎn)移是癌癥最具破壞性的因素，也是癌癥患者預(yù)后不良和死亡的主要原因。它由一系列相互關(guān)聯(lián)、循序漸進(jìn)的步驟組成，包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲。腫瘤細(xì)胞要發(fā)生遷移和侵襲，要先對(duì)ECM進(jìn)行降解，而MMP-2和MMP-9是降解ECM的主要蛋白酶〔16,17〕。因此，抑制MMP表達(dá)被認(rèn)為是預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的早期靶點(diǎn)〔18〕。本研究結(jié)果證明GL63可抑制RBE細(xì)胞的遷移侵襲能力，且呈濃度依賴性。

PCNA在細(xì)胞核內(nèi)合成，為DNA聚合酶的輔助蛋白，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要功能的核蛋白，其合成、表達(dá)與細(xì)胞周期相關(guān)。PCNA參與DNA的合成，是反映細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)，其表達(dá)在判定腫瘤良惡性和惡性程度方面有著不可替代的作用〔19〕。PCNA作為反映細(xì)胞增殖期和評(píng)定肝癌細(xì)胞核惡性度的指標(biāo)會(huì)發(fā)生顯著升高〔20〕。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明GL63有很好的體內(nèi)抗膽管癌的作用。

綜上，GL63可有效地抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，進(jìn)而阻斷STAT3磷酸化，以此影響下游蛋白表達(dá)，從而抑制了腫瘤細(xì)胞增殖和局部侵襲等惡性生物學(xué)行為并促進(jìn)其凋亡。GL63在膽管癌的治療中可發(fā)揮安全有效的抗腫瘤作用，有可能成為治療和預(yù)防膽管癌的有效藥物。