韋雪敏，李書晗，王 耀，陳夢婷，趙 麗，王志玉，萬 敏，溫紅玲

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)屬布尼亞病毒目白纖病毒科白蛉病毒屬。由其引起的SFTS是一種新發(fā)出血熱疾病，病死率高達(dá)30%[1]。自2009年發(fā)現(xiàn)SFTSV后，其發(fā)病人數(shù)逐年增加，發(fā)病區(qū)域也在不斷擴(kuò)大，截至2018年已累計有25個省報告了SFTS病例[2]。SFTSV主要通過蜱叮咬傳播，也可在人與人之間傳播[3]，且有多項報道表明患病寵物可直接將SFTSV傳染給人類[4-6]。作為一種新發(fā)病原體，目前對其生物學(xué)和理化特性的了解尚不充分。本研究主要通過觀察不同溫度對SFTSV病毒滴度的影響，了解其對溫度的敏感性，為SFTSV的消毒和實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株JS2011-013-1由江蘇省疾病預(yù)防控制中心惠贈。JS2011-013-1的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量(CCID50)為107.25/100 μL。

1.1.2 主要試劑及儀器 熒光顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)。DMEM培養(yǎng)基和青霉素-鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司, FBS購自美國Gibco公司。一抗為人源SFTSV Gn蛋白單克隆抗體(由武漢大學(xué)于學(xué)杰教授課題組惠贈)[7]。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗(山羊抗人IgG)購自美國Proteintech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溫度實(shí)驗(yàn) 將待測病毒分裝到250 μL的PCR管中，100 μL/管，分別放置在4 ℃冰箱，以及25 ℃、37 ℃、39 ℃、56 ℃、70 ℃金屬浴中。間隔預(yù)定時間后，分別取出1份樣品，用DMEM維持液(含1%滅活的胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素雙抗)對樣品做10倍梯度稀釋。

1.2.2 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn) Vero細(xì)胞接種到96孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12～18 h(細(xì)胞匯合度70%～80%)后接種上述病毒稀釋液，每個梯度設(shè)置4個平行樣，并同時設(shè)置4個病毒陽性對照和空白對照。72 h后，加入-20 ℃預(yù)冷的80%丙酮固定12 h后，棄去固定液，加入人源SFTSV Gn抗體(1∶750，抗體稀釋液稀釋)，37 ℃孵育1 h。PBS洗3次后，在避光條件下，加入FITC標(biāo)記的二抗(1∶50，PBS稀釋)，并在稀釋液中按1∶2 000加入0.5%埃文斯藍(lán)?；靹蚝螅?7 ℃孵育1 h。PBS洗3次后在熒光顯微鏡下觀察記錄熒光孔的分布。Karber法計算病毒CCID50。

2 結(jié) 果

2.1 在4 ℃、25 ℃、37 ℃和39 ℃條件下SFTSV滴度變化 隨溫度的升高，病毒滴度下降速度加快，在4 ℃、25 ℃、37 ℃和39 ℃放置24 h后由107.25/100 μL分別下降到107.00/100 μL、106.75/100 μL、106.50/100 μL、105.00/100 μL(表1)。同一溫度，隨放置時間的延長，病毒滴度下降趨勢也愈加明顯，SFTSV在4 ℃、25 ℃、37 ℃放置72 h后，病毒滴度由107.25/100 μL分別下降到106.63/100 μL、106.50/100 μL、103.38/100 μL。SFTSV在39 ℃放置72 h后完全被滅活(圖1)。

圖1 多種溫度下SFTSV隨時間病毒滴度變化情況

表1 多種溫度下SFTSV隨時間變化滅活對數(shù)值

2.2 56 ℃、70 ℃條件下對SFTSV的作用 由表2可知，56 ℃作用180 min或70 ℃ 作用5 min后，SFTSV失去活性，熒光顯微鏡下無熒光出現(xiàn)(圖2和圖3)。

表2 56 ℃和70 ℃條件下SFTSV病毒滴度變化

注：60 min、120 min和180 min代表病毒原液在金屬浴中的處理時間；101～103代表經(jīng)過預(yù)處理的病毒原液分別稀釋10倍、102倍和103倍后觀察到的熒光圖。

注：5 min和10 min代表病毒原液在金屬浴中的處理時間；101代表經(jīng)過預(yù)處理的病毒原液稀釋10倍后觀察到的熒光圖。

3 討 論

本研究以CCID50為107.25/100 μL SFTSV實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株JS2011-013-1為對象，探索SFTSV隨溫度升高病毒滴度的變化規(guī)律。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含有SFTSV的細(xì)胞培養(yǎng)上清液在冷藏(4 ℃)和室溫(25 ℃)條件下存放72 h后，病毒滴度僅輕微下降。既往研究發(fā)現(xiàn)SFTSV在4 ℃條件下放置144 h，其病毒滴度僅下降約10倍[8]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在37 ℃和39 ℃條件下，隨時間延長，病毒滴度下降速率明顯高于4 ℃和25 ℃，但存活時間仍較長，在39 ℃下放置72 h，病毒才失去感染性。這提示SFTSV離開宿主進(jìn)入外環(huán)境后，仍可長時間存活并具有感染性，該特性為其自然傳播提供了有利條件。SFTSV可通過接觸患者血液和血性分泌物傳播，甚至有研究者在感染SFTSV 12 d的雪貂體液(如尿液、唾液等)標(biāo)本中檢測到SFTSV[9-10]。另外，有醫(yī)務(wù)人員在佩戴防流感口罩和手套的防護(hù)條件下為確診患者氣管插管后感染SFTSV[11]，提示一般防護(hù)措施并不能完全抵抗SFTSV對機(jī)體的侵襲。上述氣溶膠感染案例可能是由于體內(nèi)病毒載量較高的危重癥患者會釋放出具有感染性的小粒徑氣溶膠病毒顆粒[9, 11-12]，從而造成周圍人員的感染。因此，應(yīng)重視對接觸過SFTSV的物品、SFTS患者體液沾染的物品及SFTS患者起居室的消毒。醫(yī)務(wù)人員在接觸危重癥患者時，還需額外的預(yù)防氣溶膠傳播的措施，如佩戴N95口罩等。

根據(jù)既往研究[13]，除了56 ℃，我們還探究了70 ℃ 條件下SFTSV病毒滴度的變化。SFTSV在70 ℃放置5 min，病毒即被滅活；56 ℃作用180 min，病毒才失去感染性。并且本實(shí)驗(yàn)中所用病毒株為實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株JS2011-013-1，病毒存在的環(huán)境為DMEM維持液，與離體體液中的病毒相比，其成分更簡單，對病毒的保護(hù)作用更弱，溫度對其作用可能更強(qiáng)。所以在對SFTS患者離體體液進(jìn)行熱滅活時，需要適當(dāng)提高作用溫度或延長處理時間，確保SFTSV被完全滅活。此外，外界環(huán)境中存在的介質(zhì)較多，SFTSV存活時間可能相對更長。因此，對于SFTS高發(fā)地區(qū)的居民，應(yīng)加強(qiáng)自我保護(hù)與消毒方法的宣傳教育，當(dāng)身邊有人出現(xiàn)發(fā)熱、胃腸道癥狀時，要避免接觸患者體液，同時不能忽視對患者所處環(huán)境及接觸過物品的消毒。

綜上所述，研究者對病毒進(jìn)行熱滅活時，至少要70 ℃加熱 5 min以上，避免病毒滅活不完全，出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)院內(nèi)傳播事件。

利益沖突：無

引用本文格式：韋雪敏，李書晗，王耀，等.發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒溫度敏感性研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(1)：25-28.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.176