徐新明，哈妮克孜·吐拉甫，劉劍鋒，石 剛，付雪峰，于麗娟，拉扎特·艾尼瓦爾，狄 江

(1新疆畜牧科學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000;2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,北京 100193)

羊毛性狀，如羊毛產(chǎn)量、毛纖維長(zhǎng)度、毛叢強(qiáng)力和纖維直徑，是毛用羊非常重要的選育指標(biāo)[1]，受遺傳和環(huán)境因素的影響。羊毛的生長(zhǎng)過程與毛囊的發(fā)育[2]和毛囊生長(zhǎng)周期[3-4]及毛囊細(xì)胞分化[5]有關(guān)。羊毛的生長(zhǎng)發(fā)育在分子水平上受相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，重要基因的突變會(huì)影響羊毛的生長(zhǎng)，從而造成羊毛性狀的差異。從遺傳學(xué)角度分析，篩選與羊毛性狀相關(guān)的候選基因是毛用羊分子育種的關(guān)鍵步驟[6]。然而，在最新的綿羊數(shù)量性狀基因座數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/OA/index)中，只有54個(gè)數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus，QTL)與羊毛性狀相關(guān)。此外，QTL的置信區(qū)間較長(zhǎng)，很難用其來(lái)確定影響目標(biāo)性狀的特定基因。因此，在綿羊的育種研究中，迫切需要從基因組水平挖掘更多與羊毛性狀密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)，并對(duì)SNP進(jìn)行更為精確的QTL定位，以豐富對(duì)于羊毛性狀遺傳結(jié)構(gòu)的理解。

目前基于高通量SNP技術(shù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies,GWAS)，正在取代傳統(tǒng)的QTL分析而成為更強(qiáng)大的基因檢測(cè)技術(shù)[7-8]。已有學(xué)者將GWAS成功應(yīng)用于綿羊重要經(jīng)濟(jì)性狀的QTL定位研究[9-12]，并在多個(gè)綿羊品種中鑒定出一批羊毛性狀的候選基因和QTL[13-14]。中國(guó)美利奴羊是我國(guó)主要的細(xì)毛羊品種，由我國(guó)自主培育，分為新疆型、軍墾型、科爾沁型和吉林型4個(gè)品系[15]，其遺傳結(jié)構(gòu)和群體生產(chǎn)性能存在差異。中國(guó)美利奴羊(新疆型)由澳大利亞美利奴羊和新疆細(xì)毛羊雜交育成[16]，是新疆主要的細(xì)毛羊品種，也是我國(guó)重要的毛用羊品種。目前，有關(guān)中國(guó)美利奴羊(新疆型)羊毛性狀候選基因和QTL的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究測(cè)定了中國(guó)美利奴羊(新疆型)周歲(16月齡)和成年(30月齡)的羊毛長(zhǎng)度與產(chǎn)毛量(污毛質(zhì)量)，利用GWAS鑒定羊毛性狀的候選基因和QTL位點(diǎn)，旨在探索中國(guó)美利奴羊(新疆型)羊毛性狀發(fā)育的候選基因和常見的潛在遺傳變異，為其育種提供有價(jià)值的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)羊群體概況與羊毛性狀測(cè)定

試驗(yàn)樣本來(lái)源于新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)的中國(guó)美利奴羊(新疆型)核心育種群2009-2012年出生的366只周歲母羊(33只公羊后代)。試驗(yàn)?zāi)?月中旬到11月中旬，采取牧場(chǎng)和舍內(nèi)飼養(yǎng)相結(jié)合的方式飼養(yǎng)，其他時(shí)間(冬季)人工喂養(yǎng)。初配母羊在18月齡用試情公羊試情，發(fā)情后母羊采用人工授精方法進(jìn)行配種。羔羊出生后稱體質(zhì)量，并記錄每只羔羊的生產(chǎn)日期、性別和出生類型(單羔、雙羔)。測(cè)定周歲羊(16月齡)和成年羊(30月齡)剪毛前后的體質(zhì)量(校正產(chǎn)毛量用)、產(chǎn)毛量，同時(shí)采集體側(cè)部位的毛樣并在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定羊毛長(zhǎng)度，并采集耳組織樣品低溫保存待用。

1.2 試驗(yàn)羊DNA的SNP分型

采用常規(guī)苯酚/氯仿方法提取耳組織基因組DNA。利用Illumina OvineSNP50 BeadChip中密度芯片(包括54 241個(gè)SNP位點(diǎn))在Infinium Ⅱ multisample assay (Illumina)平臺(tái)上檢測(cè)全部試驗(yàn)羊DNA樣品SNP。使用iScan(Illumina)掃描芯片檢測(cè)結(jié)果，并利用GenomeStudio軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而得到每個(gè)樣品的SNP分型數(shù)據(jù)。

將全部SNP分型結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控分析，去除不符合條件的SNP。去除條件為：雜交陽(yáng)性率(call rate)<90%，最小等位基因頻率(MAF)<3%，顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)，χ2顯著性檢驗(yàn)P<0.001)，位于性染色體上。

1.3 試驗(yàn)羊羊毛性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用single-locus回歸方法，通過PLINK軟件進(jìn)行羊毛性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析，模型如下：

y=μ+Xf+bm+Zs+e。

式中：y為表型值；μ為羊毛性狀總平均；f為固定效應(yīng)，對(duì)于周歲羊，固定效應(yīng)包括群體(6個(gè)水平)、出生類型(單羔或雙羔)、年份(2009，2010，2011，2012)、母羊年齡(初產(chǎn)、經(jīng)產(chǎn))等，對(duì)于成年羊，固定效應(yīng)包括群體(6個(gè)水平)和年份(2010，2011和2012)；b為表型值對(duì)SNP基因型的回歸系數(shù)；m為SNP基因型向量(設(shè)2為次等位基因，0、1和 2代表SNP基因型11、12和 22)；s為家系效應(yīng)；X、Z為f和s的指數(shù)矩陣；e為殘差效應(yīng)。

采用permutation方法對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果進(jìn)行校正，通過permutation 10 000次獲得2個(gè)性狀的基因組水平顯著性閾值，以-lg (P)表示。

1.4 試驗(yàn)羊SNP的基因注釋

OvineSNP50 BeadChip中的SNP主要是基于綿羊早期基因組(序列版本：Ovis_aries_v1.0)確定，綿羊早期基因組序列并不完整，部分序列之間存在缺口，需要使用最新的綿羊基因組數(shù)據(jù)重新進(jìn)行定位，以獲得準(zhǔn)確的SNP信息。因此，本試驗(yàn)首先將OvineSNP50 BeadChip基因組注釋文件在最新的綿羊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(序列版本：Ovis_aries_v3.1,http://www.livestockgenomics.csiro.au/sheep/oarv3/Oarv3.150kSNP.position.gff3)中進(jìn)行SNP的重新定位。然后，利用NCBI中的Ovisaries Annotation Release 100工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects /mapview/map_search.cgi?taxid=9940&build =100.0)鑒定與羊毛性狀顯著關(guān)聯(lián)SNP對(duì)應(yīng)或鄰近的基因。同時(shí)，基于綿羊數(shù)量性狀位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Sheep QTLdb，http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/OA/index)，利用Ovisar-ies Annotation Release 100工具對(duì)羊毛性狀顯著關(guān)聯(lián)SNP進(jìn)行比對(duì)、驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)羊羊毛性狀的描述性統(tǒng)計(jì)

由表1可知，周歲羊羊毛長(zhǎng)度平均值為10.17 cm，成年羊羊毛長(zhǎng)度平均值是9.84 cm。周歲羊產(chǎn)毛量平均為3.84 kg/只，略輕于成年羊的4.45 kg/只。試驗(yàn)羊群體羊毛性狀的平均值均在正常范圍(羊毛長(zhǎng)度5.0～20.0 cm，產(chǎn)毛量2.0～10.0 kg/只)內(nèi)，數(shù)據(jù)均在正態(tài)分布范圍內(nèi)，符合全基因組關(guān)聯(lián)分析的要求。

表1 中國(guó)美利奴羊(新疆型)羊毛性狀的描述性統(tǒng)計(jì)

2.2 試驗(yàn)羊基因組SNP的篩選

由表2可知，從試驗(yàn)羊群體中共篩選出44 798個(gè)SNP，每條染色體上的SNP數(shù)量為672～5 150個(gè)，SNP間的距離為49.97～65.59 kb 。

表2 中國(guó)美利奴羊(新疆型)基因組SNP在染色體上的分布和平均距離

2.3 試驗(yàn)羊SNP與羊毛性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析及基因注釋結(jié)果

由圖1和表3可知，本試驗(yàn)共檢測(cè)出21個(gè)與羊毛長(zhǎng)度和產(chǎn)毛量顯著關(guān)聯(lián)的SNP，分布在14條染色體上，其中1、2、4、7、8、12、13、14、15、25號(hào)染色體各有1個(gè)，6號(hào)和16號(hào)染色體各有2個(gè)，3號(hào)染色體有3個(gè)，10號(hào)染色體有4個(gè)。21個(gè)SNP中，4個(gè)SNP位于已知功能基因中，17個(gè)SNP位于已知功能基因附近。

A.周歲羊羊毛長(zhǎng)度；B.周歲羊產(chǎn)毛量；C.成年羊羊毛長(zhǎng)度；D.成年羊產(chǎn)毛量?；蚪M顯著性以圖中的水平線為限

由表3可知，對(duì)于周歲羊，有5個(gè)SNP與羊毛性狀顯著相關(guān)，其中2個(gè)(OAR2_26198532.1、OAR15_61161801.1)與羊毛長(zhǎng)度相關(guān)，3個(gè)(OAR6_111912224.1、OAR7_15117952.1、OAR1_258037376.1)與產(chǎn)毛量相關(guān)，這5個(gè)SNP的注釋基因位于9 162～143 316 bp。

表3 中國(guó)美利奴羊(新疆型)SNP與羊毛性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析及基因注釋結(jié)果

對(duì)于成年羊，有16個(gè)SNP與羊毛性狀顯著相關(guān)，其中6個(gè)(s47682.1、OAR10_39377612.1、s65179.1、OAR10_39573000.1、s55268.1、OAR3_117652254.1)與羊毛長(zhǎng)度顯著相關(guān)，6個(gè)(OAR25_10510703.1、OAR16_31063637.1、OAR3_112640501.1、s56106.1、OAR10_48636475.1、OAR8_61789156.1)與產(chǎn)毛量顯著相關(guān)，4個(gè)(OAR16_5481579.1、s63900.1、s24607.1、OAR12_63817292.1)與羊毛長(zhǎng)度和產(chǎn)毛量均顯著相關(guān)。s65179.1、OAR25_10510703.1、OAR3_112640501.1和s56106.1 4個(gè)SNP分別位于驅(qū)動(dòng)蛋白家庭成員16b(kinesin family member 16B，KIF16B)、利阿諾定受體2(ryanodine receptor 2，RYR2)、后期促進(jìn)復(fù)合亞基1(anaphase promoting complex subunit 1，ANAPC1)和二肽基肽酶6(dipeptidyl peptidase 6，DPP6)基因內(nèi)，并且這4個(gè)SNP位置均位于基因編碼區(qū)。

2.4 試驗(yàn)羊羊毛性狀顯著相關(guān)SNP與已知羊毛性狀相關(guān)QTL的比較

由表4可以看出，與綿羊QTLdb比較，有5個(gè)SNP位于已報(bào)道的與羊毛纖維長(zhǎng)度和產(chǎn)毛量相關(guān)的QTL中，分別是s63900.1、OAR3_112640501.1、OAR7_15117952.1、OAR15_61161801.1和OAR25_10510703.1。有2個(gè)SNP位于已報(bào)道的與纖維直徑均值相關(guān)的QTL中，分別是s55268.1和OAR6_111912224.1。OAR25_10510703.1位于與污毛質(zhì)量相關(guān)的QTL中，OAR12_63817292.1位于與污毛平均日增重相關(guān)的QTL中。OAR25_10510703.1定位到2個(gè)與纖維長(zhǎng)度相關(guān)的QTL(ID為14016和12919)和1個(gè)與污毛質(zhì)量相關(guān)的QTL(ID為12913)，OAR7_15117952.1定位到1個(gè)與纖維長(zhǎng)度相關(guān)的QTL(ID為14015 )和1個(gè)與初級(jí)纖維直徑變異系數(shù)相關(guān)的QTL(ID為14020)，結(jié)果表明這2個(gè)位點(diǎn)對(duì)中國(guó)美利奴羊(新疆型)羊毛長(zhǎng)度和產(chǎn)毛量具有顯著性作用。

表4 中國(guó)美利奴羊(新疆型)羊毛性狀顯著相關(guān)SNP分析

3 討 論

近年來(lái)，GWAS已經(jīng)成為動(dòng)物育種領(lǐng)域挖掘基因的有效方法，有學(xué)者基于GWAS技術(shù)已經(jīng)在綿羊上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與體質(zhì)量、抗病、肉質(zhì)和毛用性狀相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)[17-18]，但目前基于GWAS的中國(guó)美利奴羊(新疆型)羊毛性狀的SNP信息尚不清楚。本研究利用Illumina OvineSNP50 BeadChip中密度芯片對(duì)中國(guó)美利奴羊(新疆型)群體的羊毛長(zhǎng)度和產(chǎn)毛量進(jìn)行了GWAS分析，從基因組水平鑒定出21個(gè)顯著性SNP位點(diǎn)。研究表明，羊毛產(chǎn)量與年齡之間存在較低的遺傳相關(guān)性[19-20]。本試驗(yàn)將周歲羊和成年羊羊毛性狀作為獨(dú)立性狀進(jìn)行分析，并未發(fā)現(xiàn)兩者存在重疊的SNP，也未觀察到SNP的多效性現(xiàn)象，表明不同基因在羊毛發(fā)育的不同時(shí)期可能發(fā)揮不同作用，僅從單一時(shí)期獲取數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳分析，不足以挖掘出真實(shí)有效的遺傳變異信息，這要求人們?cè)诰d羊選育中應(yīng)將年齡作為重要因素進(jìn)行分析。

研究表明，F(xiàn)IBIN是斑馬魚胸鰭芽發(fā)育所必需的一種分泌因子[21]；在脊椎動(dòng)物中，F(xiàn)IBIN可調(diào)控胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的形成與發(fā)育[22]。本試驗(yàn)所鑒定的21個(gè)顯著性SNP位點(diǎn)中，OAR15_61161801.1位點(diǎn)與周歲羊羊毛纖維長(zhǎng)度顯著相關(guān)，且定位到羊毛纖維長(zhǎng)度QTL(ID：12917)，該位點(diǎn)位于FIBIN基因附近，這提示FIBIN基因可能是影響羊毛長(zhǎng)度性狀的重要功能基因。研究表明，雄激素可促進(jìn)身體不同部位的毛發(fā)生長(zhǎng)[23-24]。HSD17B11是雄酮合成酶，在雄激素代謝中發(fā)揮重要功能[25]。目前對(duì)于HSD17B11是否直接調(diào)控毛發(fā)生長(zhǎng)尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，鄰近HSD17B11基因的OAR6_111912224.1位點(diǎn)與周歲羊產(chǎn)毛量顯著相關(guān)，提示HSD17B11可能通過影響雄激素代謝而調(diào)控羊毛生長(zhǎng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，有16個(gè)SNP與成年羊毛性狀顯著相關(guān)，其中位于染色體13上的s65179.1位點(diǎn)與纖維長(zhǎng)度相關(guān)，該位點(diǎn)位于KIF16B基因中。KIF16B在功能上與表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、纖維生長(zhǎng)因子(fiber growth factor，F(xiàn)GF)和Wnt信號(hào)通路有關(guān)，而EGF、FGF和Wnt信號(hào)通路被證明在羊毛毛囊發(fā)育和纖維生長(zhǎng)中起著重要作用[26-28]。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)，中國(guó)美利奴羊(軍墾型)KIF16B也存在與纖維直徑變異系數(shù)(coefficient of variation of fiber diameter，F(xiàn)DCV)顯著相關(guān)的SNP，這表明該基因可能存在多效性現(xiàn)象。有研究證明，RYR2與皮膚角質(zhì)形成和毛囊細(xì)胞分化相關(guān)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，OAR25_10510703.1位點(diǎn)位于RYR2基因中，與纖維長(zhǎng)度和污毛質(zhì)量顯著相關(guān)，這提示RYR2可能是中國(guó)美利奴羊(新疆型)羊毛纖維長(zhǎng)度和羊毛產(chǎn)量的重要候選基因。

本試驗(yàn)對(duì)中國(guó)美利奴羊(新疆型)的羊毛長(zhǎng)度和產(chǎn)毛量進(jìn)行了GWAS分析，篩選到了相關(guān)候選基因和SNP位點(diǎn)，為該品種綿羊的育種研究提供了羊毛性狀初步候選區(qū)域和基因，為解析綿羊羊毛長(zhǎng)度和產(chǎn)毛性狀的遺傳變異奠定了基礎(chǔ)。