海闖北，彭超軍，李 艷，齊學(xué)禮，方宇輝，華 夏，許為鋼

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物分子育種研究院/河南省小麥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省麥類種質(zhì)資源創(chuàng)新與改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450002)

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，氮肥的施用為提高小麥產(chǎn)量發(fā)揮了重要作用。但許多國(guó)家在小麥生產(chǎn)中存在氮肥過度施用、氮肥利用率偏低的問題，而且氮肥的過度施用也造成面源污染[1]。因此，研究不同氮素水平對(duì)小麥形態(tài)特性和相關(guān)生理特性的影響，可為節(jié)肥高產(chǎn)品種的遺傳改良工作提供幫助[2-4]。

土壤中氮狀態(tài)的改變會(huì)引起植物的動(dòng)態(tài)反映，優(yōu)化氮素的獲取，以達(dá)到調(diào)節(jié)植物的整體生長(zhǎng)[5]。根系對(duì)氮素的吸收為光合作用提供了不可缺少的氮源[6]。根系性狀和根系構(gòu)型對(duì)植物氮素高效利用、植物健康生長(zhǎng)和生產(chǎn)力的高低有重要的影響[7-8]。施氮水平會(huì)對(duì)根系形態(tài)產(chǎn)生很大的影響，比如根的長(zhǎng)度、根尖數(shù)等[9-10]。因此，研究高、低氮條件下小麥根系性狀的變化差異，特別是不同氮素利用效率材料之間的差異，有助于進(jìn)一步了解根系對(duì)氮素吸收能力的影響以及發(fā)掘優(yōu)異的氮高效基因型資源[11]。

本試驗(yàn)擬研究高氮和低氮處理對(duì)氮高效小麥品種和氮低效小麥品種根系活力、高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)模式、以及不同時(shí)期氮代謝關(guān)鍵酶活性和氮素積累量的影響，以期為氮高效小麥品種的氮利用效率特性改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為3個(gè)氮高效小麥品種(周麥32、鄭麥1860和鄭麥7698)和3個(gè)氮低效小麥品種(R93127、豫麥61和小偃6號(hào))，均由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。本實(shí)驗(yàn)室2019-2020年度對(duì)這6個(gè)品種的氮素利用效率指數(shù)的鑒定結(jié)果：周麥32為2.104，鄭麥1860為2.959，鄭麥7698為2.967，R93127為0.261，豫麥61為0.328，小偃6號(hào)為0.184；2020-2021年度對(duì)這6個(gè)品種的氮素利用效率指數(shù)的鑒定結(jié)果：周麥32為1.306，鄭麥1860為1.375，鄭麥7698為1.423，R93127為 0.497，豫麥61為0.345，小偃6號(hào)為0.413。

1.2 水培試驗(yàn)

將在光照培養(yǎng)箱(溫度設(shè)定為白天21±1 ℃，夜間18±1 ℃；光照周期為16 h光照/8 h黑暗；光強(qiáng)為190～200 μmol·m-2·s-1)中培養(yǎng)至兩葉一心的材料移栽到裝有10 L培養(yǎng)液的生長(zhǎng)箱內(nèi)，并設(shè)高氮(5 mmol·L-1NH4NO3)和低氮 (0.5 mmol·L-1NH4NO3)兩個(gè)處理，兩個(gè)處理的其他元素含量相同，具體為1 mmol·L-1K2SO4、0.5 mmol·L-1KH2PO、5 mmol·L-1CaCl2、1 mmol·L-1MgSO4、0.1 mmol·L-1FeNaEDTA、0.001 mmol·L-1MnSO4·7H2O、0.000 5 mmol·L-1CuSO4·5H2O、0.001 mmol·L-1ZnSO4·7H2O、0.001 mmol·L-1H3BO3以及 0.000 35 mmol·L-1Na2MoO4。生長(zhǎng)箱培養(yǎng)液液面置一泡沫板(規(guī)格為6×7孔)，每孔植苗1株，放置于培養(yǎng)間，環(huán)境條件設(shè)定為白天溫度 18 ℃，晚上溫度8.5 ℃；光照14 h，每3 d換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)28 d后，取材測(cè)定。

1.3 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)于2019-2021年度在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地(河南省原陽縣橋北鄉(xiāng)平原新區(qū)，113°40′E，35°00′N，海拔77 m)進(jìn)行，試驗(yàn)地土壤類型為輕壤土，播種前土壤基礎(chǔ)肥力見表1，試驗(yàn)設(shè)高氮和低氮兩個(gè)處理，高氮處理下氮肥(純N，尿素和磷酸二胺)施用量為239.9 kg·hm-2，其中69.0 kg·hm-2在拔節(jié)期作為追肥施入，其余作為基肥施入，磷肥為磷酸二胺(P2O5172.4 kg·hm-2)、鉀肥為氯化鉀(K2O 45.0 kg·hm-2)，均作為基肥施入。低氮處理下只在磷肥施用中引入氮肥，磷肥和鉀肥使用量和方法同高氮處理。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每個(gè)材料種植4行，行長(zhǎng)2 m，行距23.3 cm，株距3.3 cm。播種時(shí)間為每年的10月7號(hào)。

表1 土壤基礎(chǔ)肥力Table 1 Basic soil fertility

1.4 水培試驗(yàn)測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1 根形態(tài)參數(shù)和根系活力的測(cè)定

移栽生長(zhǎng)箱4周后，高氮和低氮處理每個(gè)材料取長(zhǎng)勢(shì)均勻的5株植株，用Epson 2100掃描儀(Epson，日本)掃描后，用根系圖像分析軟件Win-RHIZO(Regent Instruments,加拿大)測(cè)定根長(zhǎng)、根表面積、根直徑、根體積、根尖數(shù)，按照氯化三苯基四氮(TTC)方法測(cè)定根系活力[23]。

1.4.2 根系硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)模式的測(cè)定

用MonzolTMReagent(莫納，蘇州)提取植物組織總RNA，用MonScriptTMRTIII All-in-One Mix with dsDNase(莫納，蘇州)合成cDNA。用CFX Connect Real-Time PCR (Bio-Rad)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，引物序列、PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均參考Wang等[24]的方法。用 2-ΔΔCt法[25]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，以小麥GAPDH基因作為內(nèi)參。

1.5 大田試驗(yàn)測(cè)定項(xiàng)目與方法

在各小區(qū)選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的一行，取中部50 cm的植株作為大田樣品，用剪刀除去根系。取樣時(shí)期與部位分別為：拔節(jié)期的莖鞘和葉；開花期的莖鞘、葉和穗；成熟期的莖鞘、葉、籽粒和穎殼。經(jīng)105℃殺青30 min，70℃烘干24 h至恒重后，測(cè)定干重，并采用Vario MICRO cube元素分析儀(Elementar，美國(guó))測(cè)定氮含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，由干重和氮含量計(jì)算植株地上部氮積累量(氮素積累量=干重×氮含量)。分別于齊穗期、開花期和花后15 d取生長(zhǎng)一致的小麥植株，取旗葉用于測(cè)定硝酸還原酶[26]和谷氨酰胺合成酶[27]的活性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水培條件下苗期根系相關(guān)形態(tài)及生理參數(shù)

由表2可以看出，在高氮和低氮處理下，氮高效品種的根尖數(shù)、根長(zhǎng)、根體積、根表面積和根活力均顯著高于氮低效品種。除氮低效品種的根尖數(shù)在低氮處理下略低于高氮處理外，氮高效品種和氮低效品種在低氮處理下的性狀表型值均高于高氮處理，特別是根尖數(shù)、根體積和根活力的差異比較明顯。表明雖然氮高效品種和氮低效品種的根形態(tài)和活力對(duì)低氮處理具有主動(dòng)反應(yīng)，但由于氮高效品種在根形態(tài)性狀和根系活力上本身就顯著優(yōu)于氮低效品種，對(duì)低氮環(huán)境的響應(yīng)更加明顯。

表2 高氮和低氮處理對(duì)氮高效品種和氮低效品種根形態(tài)和根活力的影響Table 2 Effect of high- and low-nitrogen treatments on root morphology and root activity of wheat varieties with different nitrogen use efficiency(NUE)

2.2 水培條件下低氮處理對(duì)根系硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量的影響

由表3可以看出，低氮處理下三個(gè)氮高效品種中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaNRT2.1、TaNRT2.2、TaNRT2.3、TaNAR2.1、TaNAR2.2和TaNAR2.3的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于三個(gè)氮低效品種，其平均值分別是三個(gè)氮低效品種平均值的1.93、2.31、2.13、2.27、2.00和3.17倍。這說明氮高效品種對(duì)低氮的響應(yīng)較為強(qiáng)烈，在低氮環(huán)境中仍具有較強(qiáng)的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

表3 低氮處理對(duì)不同硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的影響Table 3 Effect of low nitrogen treatment on relative expression levels of different nitrate transporter genes

2.3 大田條件下高氮和低氮處理對(duì)不同時(shí)期小麥旗葉硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性的影響

由表4可以看出，高氮和低氮處理下，氮高效品種在齊穗期、開花期和花后15 d的硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性均顯著高于氮低效品種；與高氮處理相比，低氮處理下氮高效品種和氮低效品種的硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性在不同時(shí)期均有所降低，其中氮高效品種的硝酸還原酶活性在齊穗期、開花期和花后15 d的降低幅度分別為16.17%、11.03%和15.51%，均低于氮低效品種(29.27%、20.66%和20.75%)；氮高效品種的谷氨酰胺合成酶活性在齊穗期、開花期和花后15 d的降低幅度分別為1.99%、10.77%和 6.92%，也均低于氮低效品種(19.89%、15.35%和13.84%)。這表明減氮對(duì)氮高效品種的硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性影響較小，而氮低效品種的硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性在高氮和低氮處理下的變化較大，反映出其對(duì)氮環(huán)境變化的敏感性。

表4 高氮和低氮處理下氮高效品種和氮低效品種旗葉硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性的差異Table 4 Comparison of nitrate reductase and glutamine synthetase activity between high nitrogen use efficiency varieties(HNV) and low nitrogen use efficiency varieties(LNV) under high-and low-nitrogen treatments U·g-1

2.4 大田條件下高氮和低氮處理對(duì)不同時(shí)期植株地上部氮素積累量的影響

從表5可以看出，高氮和低氮處理下，氮高效品種在拔節(jié)期、開花期和成熟期的氮素積累量均顯著高于氮低效品種；與高氮處理相比，低氮處理下氮高效品種和氮低效品種的氮素積累量在不同時(shí)期均有所降低，氮高效品種在拔節(jié)期、開花期和成熟期的降低幅度分別為12.62%、22.70%和 6.70%，均低于氮低效品種(24.51%、31.16%和16.56%)。表明氮高效品種的氮素積累量受低氮影響相對(duì)較小，對(duì)低氮環(huán)境具有一定的適應(yīng)性。

表5 高氮和低氮處理下氮高效品種和氮低效品種中氮素積累量的差異Table 5 Comparison of nitrogen accumulation between high nitrogen use efficiency varieties(HNV) and low nitrogen use efficiency varieties(LNV) under high-and low-nitrogen treatments g

3 討 論

根系在小麥生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著極其重要的作用，特別是對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素吸收與利用方面不可或缺，根系性狀和根系構(gòu)型成為科學(xué)家研究提高作物產(chǎn)量、品種抗逆性的重要性狀。但是根系構(gòu)型復(fù)雜，且在土體之中，因此研究難度增加[28]。植物根系通過調(diào)節(jié)其根系形態(tài)以及生理特性來適應(yīng)氮供應(yīng)水平，以滿足自身對(duì)氮素的需求[29]。而且這種生理代謝功能上的差異在低氮條件下可自身強(qiáng)化，如根系伸長(zhǎng)、根系分支數(shù)量增加等[30]。本研究表明，氮高效小麥品種在低氮環(huán)境中的根長(zhǎng)、根表面積、根直徑、根體積、根尖數(shù)和根系活力均明顯增加，增加幅度大于氮低效品種，表明氮高效品種更適應(yīng)環(huán)境的改變，在低氮條件下，根系形態(tài)和活力優(yōu)于氮低效品種[31-33]。

NRT2基因家族蛋白在低氮條件下對(duì)硝態(tài)氮的獲取發(fā)揮著重要的作用，但需要伴侶蛋白NAR2的參與[19,34]。研究發(fā)現(xiàn)，TaNRT2.1、TaNRT2.2、TaNRT2.3、TaNAR2.1、TaNAR2.2和TaNAR2.3主要在小麥根部表達(dá)[34]，本研究對(duì)這幾個(gè)基因在不同氮素利用效率材料的表達(dá)差異進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)低氮處理下TaNRT2.1、TaNRT2.2、TaNRT2.3、TaNAR2.1、TaNAR2.2和TaNAR2.3基因均上調(diào)表達(dá)，且氮高效品種上調(diào)幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氮低效品種。這進(jìn)一步從分子水平上解析了不同氮效率小麥品種中氮素吸收利用基因表達(dá)差異的代謝基礎(chǔ)。

硝酸還原酶是小麥氮素同化的限速酶(誘導(dǎo)酶)，可調(diào)節(jié)氮的代謝，促進(jìn)光合碳代謝，在一定的程度上反應(yīng)了作物對(duì)氮肥吸收利用的情況。本研究發(fā)現(xiàn)，低氮處理對(duì)氮高效品種的硝酸還原酶活性的影響較小，反映出其對(duì)低氮環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受性。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，氮高效品種的硝酸還原酶活性在齊穗期、開花期和花后15 d三個(gè)生育時(shí)期均顯著大于氮低效品種，這表明氮高效品種本身具有較強(qiáng)的硝酸鹽還原能力，有助于氮素的同化積累。谷氨酰胺合成酶作為小麥氮代謝的關(guān)鍵酶，在銨鹽同化方面發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，氮高效品種的谷氨酰胺合成酶活性在高氮和低氮處理下均大于氮低效品種，且氮高效品種的谷氨酰胺合成酶活性在齊穗期、開花期和花后15 d三個(gè)生育時(shí)期均顯著高于氮低效品種，表明氮高效品種具有更強(qiáng)的銨同化能力。

氮素積累量反映作物的吸收能力。本研究發(fā)現(xiàn)，氮高效品種在高氮和低氮處理下拔節(jié)期、開花期和成熟期的氮素積累量均高于氮低效品種，另外，氮高效品種在低氮處理下，其氮素積累量較高氮環(huán)境的降低幅度顯著小于氮低效品種，這與本研究發(fā)現(xiàn)的低氮處理下氮高效品種在根系形態(tài)和活力、硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)模式以及氮代謝關(guān)鍵酶的自我調(diào)節(jié)適應(yīng)性的變化是一致的。這也表明，改良小麥品種的氮效率特性，可從根系形態(tài)特性、根系活力、硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因以及氮代謝關(guān)鍵酶等因素來考慮，實(shí)現(xiàn)這幾個(gè)因素的有機(jī)結(jié)合。在今后小麥氮高效遺傳育種中，可著重考慮這幾個(gè)影響氮效率的關(guān)鍵因素，通過傳統(tǒng)育種、分子輔助選擇技術(shù)、轉(zhuǎn)基因以及基因編輯技術(shù)等多途徑實(shí)現(xiàn)多種相關(guān)氮效率因素的有機(jī)結(jié)合，選育出更高效、更綠色的新品種。

4 結(jié) 論

氮高效品種和氮低效品種在低氮處理下其根系相關(guān)性狀(根長(zhǎng)、根表面積、根直徑、根體積、根尖數(shù)和根系活力)以及硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因(TaNRT2.1、TaNRT2.2、TaNRT2.3、TaNAR2.1、TaNAR2.2和TaNAR2.3)的表達(dá)水平均高于高氮處理，但氮高效品種的增幅大于氮低效品種；氮高效品種氮代謝關(guān)鍵酶(硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶)的活性高于氮低效品種，低氮處理下均有所降低，但氮高效品種的降幅小于氮低效品種。這些結(jié)果在一定程度上解釋了氮高效品種在各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的氮素積累量均比氮低效品種高的原因。根系形態(tài)、根系活力、硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因和氮代謝關(guān)鍵酶活性的綜合改良是選育氮高效品種的基礎(chǔ)。