李春鑫，趙明忠，韓留鵬，高 崇，李正玲，王 艷，昝香存，胡 琳

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物分子育種研究院，河南鄭州 450002)

小麥農(nóng)家品種遺傳差異大，性狀表型變異豐富，是小麥種質(zhì)資源重要組成部分，在人類社會(huì)發(fā)展過程中，對全球小麥生產(chǎn)發(fā)揮著基礎(chǔ)性作用。隨著現(xiàn)代育種技術(shù)的興起，地方品種逐漸被現(xiàn)代品種代替，但隨著現(xiàn)代品種的增多，生產(chǎn)上種植的品種逐漸出現(xiàn)了遺傳基礎(chǔ)狹窄、抗性降低、品質(zhì)類型單一等問題。河南省是我國小麥傳統(tǒng)核心種植區(qū)，處于南北氣候類型過渡地帶，在漫長的傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，保留了豐富的地方品種，是今后小麥育種和遺傳改良的重要基因來源。

隨著社會(huì)生活水平的提高，人們對小麥?zhǔn)称返囊蟾尤妫瑐鹘y(tǒng)小麥制品如饅頭、面條的色澤等外觀特性作為制成品品質(zhì)的直觀體現(xiàn)，已成為小麥品質(zhì)育種的一個(gè)重要改良目標(biāo)。小麥制品的色澤相關(guān)基因中，PPO活性是影響在存放期間面粉顏色褐化的主要原因[1]，而LOX可以提高小麥面粉的白度，對小麥的加工價(jià)值有較大影響[2-3]。

在小麥育種中，通過分子標(biāo)記選擇低PPO活性和高LOX活性的育種材料是品質(zhì)改良的普遍做法[3-6]。小麥的LOX活性是受多基因控制的數(shù)量性狀，在染色體第四和第五同源群的4A、4B、4D、5A、5B和5D染色體上均發(fā)現(xiàn)了LOX QTL[4,7]。Geng等[8]發(fā)現(xiàn)，來自染色體4BS的TaLox-B1基因?qū)OX活性起重要的調(diào)控作用，其互補(bǔ)性檢測標(biāo)記LOX16和LOX18，是目前LOX分子輔助育種的主要檢測標(biāo)記，可以準(zhǔn)確地完成對LOX基因的檢測[4,6,9]。

PPO可以解釋面制品褐化變異的50%～70%[10]，是一個(gè)高遺傳力性狀，其主效控制基因位于2AL和2DL上，兩個(gè)位點(diǎn)對表型變異的解釋均在25%以上[11]。Sun等[12]開發(fā)了共顯性STS標(biāo)記PPO18，能夠有效區(qū)分2AL上面的PPO-A1a和PPO-A1b；He等[13]開發(fā)了兩個(gè)互補(bǔ)型的STS標(biāo)記PPO16和PPO29，用于準(zhǔn)確檢測另一個(gè)主要位點(diǎn)基因PPO-D1a和PPO-D1b；He等[13]開發(fā)出了另一個(gè)用于檢測PPO 2AL位點(diǎn)的功能標(biāo)記PPO33。同時(shí)利用以上四個(gè)標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)對低PPO活性親本和分離單株的篩選。

本研究以河南省不同地市的308份小麥地方品種為材料，利用LOX16、LOX18、PPO16、PPO18、PPO29和PPO33 共6個(gè)功能標(biāo)記對河南省特色地方品種進(jìn)行LOX及PPO基因檢測，以明確其在河南省地方品種中的分布，為小麥品質(zhì)育種材料選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用河南省小麥地方品種均來自于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所資源研究室種質(zhì)庫，所有品種在試驗(yàn)前均經(jīng)過連續(xù)兩年的田間嚴(yán)格去雜和性狀一致性鑒定，本研究選取了308份背景純合、多樣性好的地方品種作為供試材料，品種名稱和來源詳見表1。

表1 供試小麥品種及其檢測基因型Table 1 Wheat varieties and genotypes in the experiment

(續(xù)表1 Continued table 1)

(續(xù)表1 Continued table 1)

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品種名稱Varietyname收集地Collectionplace標(biāo)記MarkerPPO18PPO33PPO16PPO29LOX16LOX18老來紅Laolaihong沁陽QinyangPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b小佛手Xiaofoshou濟(jì)源JiyuanPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b紅禿頭Hongtutou濟(jì)源JiyuanPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b白疙瘩頭Baigedatou修武XiuwuPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b方頭麥Fangtoumai修武XiuwuPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b半截芒Banjiemang修武XiuwuPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b蚰子麥Youzimai封丘FengqiuPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b小紅芒Xiaohongmang鄭州ZhengzhouPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1a紅曲芒Hongqumang鄭州ZhengzhouPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b早半月Zaobanyue淅川XichuanPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b旱早八斗Hanzaobadou中牟ZhongmuPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b紅禿頭Hongtutou蘭考LankaoPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b透龍碑Toulongbei通許TongxuPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b禿頭麥Tutoumai杞縣QixianPPO-A1aPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b紅芒紅Hongmanghong柘城ZhechengPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b密穗麥Misuimai睢縣SuixianPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b三月黃Sanyuehuang洛陽LuoyangPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b老紅麥Laohongmai洛陽LuoyangPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b出山豹Chushanbao嵩縣SongxianPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b硬四裝Yingsizhuang嵩縣SongxianPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b三月黃Sanyuehuang盧氏LushiPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b知了麥zhiliaomai盧氏LushiPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1bTaLox-B1b小三月黃Xiaosanyuehuang盧氏LushiPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1bTaLox-B1b白疙瘩Baigeda盧氏LushiPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b薄地耩B(yǎng)odijiang盧氏LushiPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b灰灰糙Huihuicao盧氏LushiPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b火麥Huomai盧氏LushiPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b笨四月黃Bensiyuehuang盧氏LushiPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b和尚頭Heshangtou欒川LuanchuanPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b紅稈糙Honggancao欒川LuanchuanPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1bTaLox-B1b小白麥Xiaobaimai靈寶LingbaoPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b白疙瘩Baigeda靈寶LingbaoPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b紅和尚頭Hongheshangtou靈寶LingbaoPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1a金裹銀Jinguoyin三門峽SanmenxiaPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1a硬四裝Yingsizhuang伊川YichuanPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b硬八裝Yingbazhuang澠池MianchiPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b蜷洋麥Juanyangmai許昌XuchangPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b黃瓜先Huangguaxian郾城YanchengPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b小籽白Xiaozibai禹縣YuxianPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b紅芒白麥Hongmangbaimai鄢陵YanlingPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b紅和尚頭Hongheshangtou泌陽BiyangPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b二芒麥Ermangmai泌陽BiyangPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b螞蚱眉Mazhamei泌陽BiyangPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b大頭笨Datouben泌陽BiyangPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b三白麥Sanbaimai平輿PingyuPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1a玉麥Yumai平輿PingyuPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1bTaLox-B1b蚰子麥Youzimai平輿PingyuPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b紅芒白Hongmangbai上蔡ShangcaiPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b蚰子麥Youzimai上蔡ShangcaiPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b望水白Wangshuibai信陽XinyangPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b望山白Wangshanbai光山GuangshanPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b白和尚頭Baiheshangtou新縣XinxianPPO-A1bPPO-A1bPPO-D1aTaLox-B1b二糙麥Ercaomai淮陽HuaiyangPPO-A1aPPO-A1aPPO-D1aTaLox-B1b

(續(xù)表1 Continued table 1)

(續(xù)表1 Continued table 1)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

每份材料挑選飽滿種子5粒，放置于玻璃培養(yǎng)皿中20 ℃發(fā)苗培養(yǎng)，7～10 d后，剪取生長健康葉片參照Lagudah等方法[14]提取DNA，用1%瓊脂糖檢測DNA提取質(zhì)量，所有樣品DNA均稀釋為100 ng·μL-1備用。

1.2.2 面粉色澤相關(guān)基因檢測

試驗(yàn)用PPO-A1的功能標(biāo)記PPO18、PPO33和PPO-D1位點(diǎn)的互補(bǔ)型功能標(biāo)記PPO16、PPO29檢測品種間多酚氧化酶基因；用TaLox-B1的兩個(gè)互補(bǔ)型功能標(biāo)記LOX16和LOX18檢測脂肪氧化酶基因，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體序列見表2。

表2 基因檢測所用分子標(biāo)記引物序列、退火溫度、預(yù)期擴(kuò)增條帶大小及相應(yīng)等位基因Table 2 Primer sequence,annealing temperature,expected amplified band size and corresponding allele of the molecular markers used in the genes detection

PCR擴(kuò)增在Mastercycler Pro S(Eppendorf AG,Hamburg,Germany)上進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括：2 μL DNA模板，1.0 μL 10 × buffer(Mg2+)，0.2 μL dNTPs(10 pmol·μL-1)，上、下游引物各0.2 μL(10 pmol·μL-1) ，0.06 UTaqDNA polymerase(5 U·μL-1),6.34 μL 無菌水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃變性 5 min；94 ℃變性30 s,60 ℃退火30～50 s，72 ℃延伸 45～60 s，36個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用EXCEL對電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚氧化酶基因檢測結(jié)果

PPO18是共顯性功能標(biāo)記，可以精確檢測高多酚氧化酶活性基因PPO-A1a和低多酚氧化酶基因PPO-A1b[15]，其擴(kuò)增片段分別為685 bp和876 bp(圖1)。在308份地方品種中，檢測到攜帶PPO-A1a基因型的共有133個(gè)品種，頻率為 43.18%，攜帶PPO-A1b基因型的品種共175個(gè)，頻率為56.82%(表1)；同一個(gè)位點(diǎn)的另一個(gè)標(biāo)記PPO33擴(kuò)增結(jié)果(圖2)顯示，攜帶PPO-A1a基因的共有131個(gè)品種，出現(xiàn)頻率為 42.53%，攜帶PPO-A1b基因的品種共177個(gè)，頻率為57.47%。兩個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果比較顯示，308個(gè)不同地方品種中，兩個(gè)品種(拳芒麥和白芒麥)擴(kuò)增結(jié)果不一致，標(biāo)記PPO18對兩個(gè)品種的擴(kuò)增結(jié)果為PPO-A1a、PPO-A1b，而標(biāo)記PPO33對兩個(gè)品種的擴(kuò)增結(jié)果為PPO-A1b、PPO-A1a，兩個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果符合度為99.35%。

M:DNA ladder 2000；1～12：品種。下同。

圖2 標(biāo)記PPO33對部分品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification from partial landraces with marker PPO33

多酚氧化酶基因位點(diǎn)PPO-D1的兩個(gè)標(biāo)記PPO16和PPO29也是互補(bǔ)型標(biāo)記，分別用于檢測等位基因PPO-D1a(中等低多酚氧化酶活性)和PPO-D1b(中等高多酚氧化酶活性)[15]，其相應(yīng)擴(kuò)增片段為713 bp(圖3)和490 bp(圖4)。利用標(biāo)記PPO16對308個(gè)地方品種擴(kuò)增，檢測出目標(biāo)基因282個(gè)，頻率為91.56%；利用PPO29檢測到含有目的基因的品種數(shù)為26個(gè)，頻率為 8.44%，兩個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果完全吻合。

圖3 標(biāo)記PPO16對部分品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification from partial landraces with marker PPO16

圖4 標(biāo)記PPO29對部分品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification from partial landraces with marker PPO29

2.2 脂肪氧化酶基因檢測結(jié)果

兩個(gè)互補(bǔ)型分子標(biāo)記LOX16和LOX18所檢測的目標(biāo)是脂肪氧化酶基因TaLox-B1a和TaLox-B1b。其中，TaLox-B1a的擴(kuò)增片段為489 bp(圖5)，是高活性脂肪氧化酶，TaLox-B1b的擴(kuò)增片段為791 bp(圖6)，是低活性脂肪氧化酶基因[9]。在308個(gè)品種中，攜帶TaLox-B1b和TaLox-B1a的品種數(shù)量分別為287和21，其頻率分別為93.18%和6.82%。

圖5 標(biāo)記LOX16對部分品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification from partial landraces with marker LOX16

圖6 標(biāo)記LOX18對部分品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR amplification from partial landraces with marker LOX18

2.3 小麥面粉色澤性狀優(yōu)異基因組合分析

在306個(gè)供試品種中(不包括拳芒麥和白芒麥)，低活性多酚氧化酶基因型組合(PPO-A1b/PPO-D1a)、較低活性多酚氧化酶基因型組合 (PPO-A1a/PPO-D1a)、較高活性多酚氧化酶基因型組合(PPO-A1b/PPO-D1b)和高活性多酚氧化酶基因型組合(PPO-A1a/PPO-D1b)在306個(gè)地方品種中品種數(shù)分別為166、10、114和16。

低活性多酚氧化酶和高活性脂肪氧化酶可增加面粉及其制品的色澤品質(zhì)，不同活性多酚氧化酶基因和脂肪氧化酶基因組合代表了不同的面粉色澤性狀表現(xiàn)，表3是根據(jù)分子標(biāo)記檢測結(jié)果所統(tǒng)計(jì)的8種不同基因型組合及其攜帶品種的數(shù)量。因?yàn)樯袩o多酚氧化酶和脂肪氧化酶基因各自對面粉色澤表型解釋值比較的報(bào)道，因此，無法對8種不同基因型組合所代表的色澤性狀表型進(jìn)行精確排序，推測最優(yōu)組合為PPO-A1b/PPO-D1a/TaLox-B1a，最差組合為PPO-A1a/PPO-D1b/TaLox-B1b，在306個(gè)品種中，兩種基因型組合數(shù)量為11和16。

表3 PPO和LOX兩個(gè)性狀不同基因型組合及其品種數(shù)量Table 3 The variety number with different genotypecombinationfor PPO and LOX

3 討 論

小麥多酚氧化酶和脂肪氧化酶作為影響小麥面粉及其制品色澤的重要性狀，相關(guān)基因的分子標(biāo)記在現(xiàn)代品種中的應(yīng)用報(bào)到較多[3-6,9]，但是對河南省地方品種的檢測尚未見報(bào)道。曹 東等[4]對甘肅近10年的審定品種進(jìn)行了PPO和LOX基因檢測，發(fā)現(xiàn)TaLox-B1b的頻率是TaLox-B1a的3倍以上，4個(gè)PPO等位基因頻率基本接近；這與吳培培等[6]對黃淮地區(qū)306份品種的LOX基因檢測結(jié)果基本一致；陳 泠等[17]在對全國277份育成品種的PPO等位基因檢測后，發(fā)現(xiàn)PPO-A1b在河南品種中頻率只有28.6%，亟需在后續(xù)品種中加強(qiáng)PPO-A1b利用。本研究首次對作為黃淮小麥親本重要來源的地方品種的相關(guān)基因進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，攜帶PPO-A1b的品種數(shù)量比PPO-A1a的品種高13.72%(拳芒麥和白芒麥在等位基因PPO-A1a、PPO-A1b統(tǒng)計(jì)時(shí)去除)，與前人報(bào)道的黃淮地區(qū)現(xiàn)代品種中的PPO-A1b比例偏低相比改善明顯，而PPO-D1a、PPO-D1b在品種中分布極不均勻，低多酚氧化酶活性基因PPO-D1a占支配地位，出現(xiàn)頻率是PPO-D1b的10.8倍，因此，低活性多酚氧化酶基因型組合 (PPO-A1b/PPO-D1a)在306份品種中有166個(gè)，活性占比為54.25%，表明河南小麥地方品種的低活性多酚氧化酶基因分布整體表現(xiàn)較為 理想。

有研究認(rèn)為，PPO-A1的效應(yīng)顯著大于PPO-D1[11,16]，較低活性多酚氧化酶基因型組合 (PPO-A1b/PPO-D1b)、較高活性多酚氧化酶基因型組合(PPO-A1a/PPO-D1a)和高活性多酚氧化酶基因型組合(PPO-A1a/PPO-D1b)在306個(gè)地方品種中分別有114、10和16個(gè)，頻率分別為37.25%、3.27%和5.23%，高和較高活性多酚氧化酶基因型組合僅為8.50%，說明河南省地方品種的多酚氧化酶性狀是以中、低活性基因型為 主體。

脂肪氧化酶基因主要影響面粉貯藏期間的白度[9]，是小麥育種一個(gè)重要品質(zhì)指標(biāo)，LOX16和LOX18是LOX位點(diǎn)主要的檢測標(biāo)記，本研究檢測結(jié)果顯示，攜帶低活性脂肪氧化酶基因TaLox-B1b的品種數(shù)量是高活性脂肪氧化酶基因TaLox-B1a品種的13.67倍，即河南省地方品種中面粉白度優(yōu)異基因型頻率較低，需要在親本組合選配時(shí)加入高活性脂肪氧化酶基因品種。綜合考慮脂肪氧化酶和多酚氧化酶基因，優(yōu)異基因型組合為PPO-A1b/PPO-D1a/TaLox-B1a，在306個(gè)品種中，只有11個(gè)品種具有這種基因型組合，其頻率為3.59%，而最差組合為PPO-A1a/PPO-D1b/TaLox-B1b，共有16個(gè)品種攜帶此基因型組合，這表明河南省的地方品種中面粉色澤基因型組合整體呈現(xiàn)類正態(tài)分布的狀態(tài)，最優(yōu)和最差基因型組合的品種數(shù)量少，而中間類型品種占主體地位(表3)。

本試驗(yàn)中，除標(biāo)記PPO18和PPO33在品種拳芒麥和白芒麥中不一致外，其他結(jié)果均相互吻合。對于標(biāo)記PPO18和PPO33在個(gè)別品種中的檢測差異，我們推斷可能是兩個(gè)地方品種在長期自交過程中，在PPO-A1位點(diǎn)出現(xiàn)了自然變異，在基因擴(kuò)增區(qū)段發(fā)生序列/結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致了檢測結(jié)果的差異，更直接的證據(jù)需要通過進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。