徐金青，邊海燕，王寒冬，王 蕾，張 波，尤 恩，李曉蘭，陳文杰，沈?；?/p>

(1.中國科學(xué)院高原適應(yīng)與進化重點實驗室/青海省作物分子育種重點實驗室/青藏高原作物種質(zhì)資源研究與利用實驗室,中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧 810001;2.中國科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院,青海西寧 810001;3.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100049)

燕麥?zhǔn)且荒晟瘫究谱魑?，其栽培種多以六倍體(2n=6x=42)普通燕麥(AvenasativaL.)為主。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計，近年來燕麥產(chǎn)量保持在 2 000萬t以上，在世界禾谷類作物中的種植面積和總產(chǎn)量次于小麥、玉米、水稻、大麥和高粱，居第六位[1]。燕麥富含β-葡聚糖，具有降血脂、維持血糖平衡和抑制膽固醇吸收的功效[2]，是美國FDA和英國JHCI認定的功能性谷物[3-4]。普通栽培燕麥分為皮燕麥和裸燕麥兩種，中國栽培的燕麥主要為裸燕麥，主要分布在華北、西北、西南等地區(qū)，是重要的營養(yǎng)保健作物和搭配作物，也是優(yōu)質(zhì)的飼草作物。

隨著燕麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，優(yōu)質(zhì)燕麥品種數(shù)目不斷增加，加上種質(zhì)交流的日趨頻繁，導(dǎo)致目前種業(yè)市場上種質(zhì)混淆現(xiàn)象和套牌侵權(quán)現(xiàn)象時有發(fā)生。同時，在育種過程中，一批綜合性狀優(yōu)良、配合力好的親本被廣泛應(yīng)用，造成品種的遺傳基礎(chǔ)變窄以及近似品種數(shù)量增加，難以用形態(tài)學(xué)、生理生化等方法準(zhǔn)確鑒定品種的真實性和純度[5]。解決這些問題的根本在于對種質(zhì)資源、育種材料和作物品種進行有效保護，從DNA水平上對農(nóng)作物品種和材料進行鑒定是實施品種保護的基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記因其檢測結(jié)果不受環(huán)境影響，操作簡單，檢測快速，且成本較低，被國際種子檢驗協(xié)會(ISTA)、國際植物新品種保護聯(lián)盟(UPOV)、國際種子聯(lián)盟(ISF)等國際組織推薦為品種身份鑒定的輔助方法[5-6]。研究者已在大麥[5]、水稻[7]、棉花[8-9]、油菜[10]等多個物種中開展了DNA指紋圖譜的構(gòu)建工作。劉偉[11]利用3對SSR引物構(gòu)建了可區(qū)分3種不同倍性燕麥材料的指紋圖譜。郭紅媛等[12]利用公共數(shù)據(jù)庫中的25 376條EST(Expressed sequence tags)序列，篩選得到40對有效的EST-SSR標(biāo)記，可用于燕麥種質(zhì)資源的基因組倍性鑒定。高 秋等[13]篩選出6對多態(tài)性好且擴增穩(wěn)定清晰的SSR引物，并使用其中2對引物構(gòu)建了10個國審燕麥品種的DNA指紋圖譜，為燕麥品種的真?zhèn)舞b定提供了可用標(biāo)記。

與SSR標(biāo)記相比，SNP標(biāo)記在基因組中分布密度更高、更均勻，且分型簡單，更適合數(shù)據(jù)整合和共享，此外，其與功能基因尤其是植物表型基因關(guān)聯(lián)度較高，因此，SNP標(biāo)記被公認為是極具應(yīng)用前景的分子標(biāo)記技術(shù)[7]。但是，目前尚未見SNP標(biāo)記用于燕麥指紋圖譜構(gòu)建的研究報道。本研究運用燕麥iSelect 6K微珠芯片[14]對25個生產(chǎn)上大面積推廣的栽培燕麥品種進行基因分型，從中篩選出能夠區(qū)分燕麥品種的核心SNP標(biāo)記，并構(gòu)建參試燕麥品種的DNA指紋圖譜，以期為燕麥種質(zhì)資源的科研、生產(chǎn)和推廣工作提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取25個生產(chǎn)上大面積推廣的普通燕麥栽培品種(表1)，在三葉期取新鮮葉片，用CTAB方法[15]提取基因組DNA，并采用紫外分光光度法檢測基因組DNA濃度，稀釋至100 ng·μL-1，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 25個普通燕麥栽培品種種質(zhì)資源Table 1 Germplasm resources of 25 common oat cultivars

1.2 芯片基因分型及數(shù)據(jù)處理

用燕麥iSelect 6K微珠芯片對參試燕麥品種進行基因分型。該芯片含有4 975個多態(tài)性SNP標(biāo)記。利用北京佳安衛(wèi)康科技有限公司的Illumina SNP Genotyping技術(shù)測試平臺完成iSelect 6K微珠芯片檢測。獲得的雜交信號輸入Genomestudio V1.0軟件進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。根據(jù)SNP標(biāo)記特性保留符合以下條件的SNP標(biāo)記：(1)具有多態(tài)性；(2)缺失率小于0.50；(3)最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)大于0.05。采用PowerMarker V3.25[16]軟件計算篩選獲得的SNP標(biāo)記的雜合率和遺傳多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)。

1.3 群體結(jié)構(gòu)分析

用PowerMarker V3.25計算Nei氏遺傳距離矩陣，用MEGA 6.0[17]的鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建聚類樹。用Admixture軟件[18]分析群體結(jié)構(gòu)，群體數(shù)K值設(shè)定為1～10。用GCTA軟件[19]進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，并利用前兩個主成分進行作圖。

1.4 核心SNP標(biāo)記的選擇及引物設(shè)計

根據(jù)基因分型的結(jié)果，篩選無基因型數(shù)據(jù)缺失的SNP用于構(gòu)建燕麥DNA指紋圖譜。用GenStat的去冗余(IRREDUNDANT)指令通過順序算法(Sequential algorithm)[6,20]篩選出能將25份燕麥栽培品種完全區(qū)分開的核心SNP標(biāo)記，標(biāo)記序列詳見參考文獻14，用Primer 6中設(shè)計相應(yīng)的PCR引物，由上海生工生物有限公司 合成。

1.5 核心SNP標(biāo)記的準(zhǔn)確性驗證

PCR擴增引物稀釋至10 μmol·L-1，DNA濃度稀釋至100 ng·μL-1。PCR反應(yīng)體系為 25 μL，包含2 μL樣品DNA，2 μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液，1.6 μL 2.5 mmol ·L-1dNTP溶液，0.5 μL 10 μmol·L-1正向引物，0.5 μL 10 μmol ·μL-1反向引物，0.2 μL Taq DNA聚合酶，18.2 μL超純水。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 4 min；95 ℃變性30 s，退火溫度(具體見表2) 45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進行測序。將測序結(jié)果與芯片分型結(jié)果進行比較，保留芯片分型結(jié)果與測序結(jié)果一致的核心SNP標(biāo)記。若測序結(jié)果與芯片分型結(jié)果不一致，則重新選擇SNP標(biāo)記進行擴增和測序驗證，直到獲得能夠完全區(qū)分25份燕麥種質(zhì)資源的核心SNP。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因分型結(jié)果

利用燕麥iSelect 6K微珠芯片對本研究選取的25個燕麥栽培品種進行基因分型，結(jié)果表明，2 852(57.33%)個SNP標(biāo)記具有多態(tài)性。刪除缺失率大于50%和MAF小于0.05的標(biāo)記，最終篩選到 2 214個SNP標(biāo)記，其基因型檢出率為97.96%。利用Powermarker V3.25軟件計算SNP標(biāo)記的雜合率，發(fā)現(xiàn)392個標(biāo)記的雜合率小于0.05，占17.71%；757個標(biāo)記的雜合率大于 0.50，占 34.19%。2 214個SNP標(biāo)記的MAF均值為 0.75，PIC均值為0.28，變化范圍為0.11～ 0.58，PIC值大于0.25的占63.23%。因此，通過燕麥iSelect 6K微珠芯片獲得的SNP標(biāo)記具有較高的多態(tài)性和可信度，可用于燕麥品種的指紋圖譜構(gòu)建與品種鑒定分析。

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

基于Nei氏遺傳矩陣?yán)L制NJ聚類樹，結(jié)果(圖1)顯示，25個普通栽培燕麥品種可以劃分為5個類群。類群Ⅰ含有4個皮燕麥和2個裸燕麥品種；類群Ⅱ含有5個皮燕麥品種；類群Ⅲ含有4個裸燕麥和1個皮燕麥品種；類群Ⅳ含有3個皮燕麥品種；類群Ⅴ中含有3個皮燕麥和3個裸燕麥品種。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖2)顯示，當(dāng)K=2時，交叉檢驗誤差(CV-error)最小，結(jié)合聚類分析結(jié)果，類群Ⅰ和類群Ⅴ聚為一個群體，剩余的組成另外一個群體。當(dāng)K=3時，類群Ⅰ組成群體1，類群Ⅱ和類群Ⅲ組成群體2，類群Ⅳ和類群Ⅴ組成群體3。當(dāng)K=4時，類群Ⅱ、類群Ⅲ分開。當(dāng)K=5時，類群Ⅳ、類群Ⅴ分開。PCA結(jié)果(圖3)顯示，第一主成分(PCA1)可解釋11.10%的遺傳變異，可將類群Ⅱ和類群Ⅲ與其他三個類群分開。第二主成分(PCA2)可解釋9.24%的遺傳變異，可將類群Ⅰ與類群Ⅳ和類群Ⅴ區(qū)分開來。

圖1 25個燕麥品種的聚類分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the 25 oat cultivars

圖下方的品種編號對應(yīng)表1的品種。

圖3 25個燕麥品種的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of the 25 oat cultivars

2.3 核心SNP標(biāo)記的篩選及擴增驗證結(jié)果

綜合考慮基因分型的結(jié)果，篩選無基因型缺失的標(biāo)記用于構(gòu)建DNA指紋圖譜，結(jié)果共獲得 1 828個SNP標(biāo)記。利用GenStat發(fā)現(xiàn)，區(qū)分25個燕麥品種至少需要8個SNP標(biāo)記(表2)。根據(jù)SNP標(biāo)記的側(cè)翼序列，設(shè)計相應(yīng)的引物進行PCR擴增和測序驗證，發(fā)現(xiàn)8個SNP標(biāo)記 (GM1～GM8)的測序結(jié)果與芯片分型結(jié)果一致(表2)，進一步證實這些核心SNP標(biāo)記的可用性和準(zhǔn)確性。8個SNP標(biāo)記的MAF均值為0.62，PIC均值為0.35，其中GM2的PIC值最高，為 0.37，GM7的PIC值最低，為0.23，表明這8個SNP標(biāo)記具有較高的遺傳多樣性。

表2 篩選出的8個SNP標(biāo)記及其引物信息Table 2 Eight SNP markers screened out and their primer information

2.4 燕麥品種指紋圖譜的構(gòu)建

利用篩選出的8個SNP標(biāo)記構(gòu)建25個參試燕麥品種的DNA指紋圖譜(表3)，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可實現(xiàn)對燕麥品種真實性和特異性的有效鑒定。

表3 25個普通燕麥品種的指紋圖譜Table 3 Fingerprint of the 25 common oat cultivars

3 討 論

品種審定、登記及品種權(quán)保護，都必須通過DUS(Distinctness,uniformity and stability)測試，即對植物品種進行特異性、一致性和穩(wěn)定性的種植鑒定試驗。目前DUS測試主要依據(jù)外部形態(tài)來確定，分子標(biāo)記只作為輔助手段。隨著燕麥二倍體和六倍體基因組的相繼發(fā)布[21]，與油含量、蛋白質(zhì)含量、β-葡聚糖含量、抗病性、粒重、分蘗數(shù)、抽穗期、株高等諸多性狀相關(guān)的QTL被發(fā)現(xiàn)和定位[22]，與這些QTL緊密連鎖的功能標(biāo)記既可用于目標(biāo)性狀檢測，也可用于指紋圖譜的構(gòu)建[6-7]。因此，與表型性狀QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以運用到DUS測試中，有利于減少田間種植成本以及提高檢測的可靠性和效率。

將DNA指紋圖譜應(yīng)用于品種鑒定時，其結(jié)果的可靠程度主要依賴于分子標(biāo)記的穩(wěn)定性和多態(tài)性[9]。隨著高通量測序和芯片技術(shù)的發(fā)展，發(fā)掘高質(zhì)量SNP標(biāo)記組合為燕麥品種的遺傳多樣性及身份鑒定提供了有效途徑。本研究選取了25個燕麥育成品種，既考慮到參試品種的來源地，又考慮到品種的育成年代和推廣應(yīng)用情況，具有較好的代表性。在群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中，NJ聚類樹、群體結(jié)構(gòu)分析及主成分分析的結(jié)果基本一致，可以將25個燕麥育成品種劃分為5個類群。但是從類群的劃分結(jié)果看，聚類分析的結(jié)果與育種單位、育種方式?jīng)]有明顯的關(guān)系。類群II和類群III的劃分同燕麥的皮裸性密切相關(guān)。同時，本研究獲得的8個SNP標(biāo)記組合可將25個參試燕麥品種完全區(qū)分開，其PIC均值為0.35，說明這8個SNP位點多態(tài)性較高。另外，經(jīng)過多次測序驗證，均和基因分型結(jié)果一致且具有良好的重現(xiàn)性，說明這8個SNP標(biāo)記適于構(gòu)建燕麥品種指紋圖譜，可以運用到燕麥品種的真實性鑒定和種子純度鑒定中。

從本課題組前期對288個燕麥品種(大部分為國外地方品種和育成品種)進行iSelect 6K微珠芯片基因分型的結(jié)果(未發(fā)表)來看，青海444、巴燕4號和青燕1號以及科燕1號和白燕7號這兩組材料均未能完全區(qū)分開來，只能用缺失標(biāo)記進行區(qū)分。但是根據(jù)缺失標(biāo)記設(shè)計引物，后續(xù)未能得到成功驗證。說明燕麥iSelect 6K微珠芯片近 5 000個SNP標(biāo)記對大群體材料的分辨力還不足，后續(xù)還需增加標(biāo)記密度開發(fā)新的芯片才可滿足燕麥種質(zhì)資源鑒定的需求。經(jīng)過測序驗證，本研究挑選的8個SNP標(biāo)記能夠完全區(qū)分生產(chǎn)上曾大面積推廣應(yīng)用的25個燕麥栽培品種。從理論上講，SNP標(biāo)記為二態(tài)時，8個標(biāo)記可以將256(28=256)個品種完全區(qū)分開來，因此本研究篩選得到的SNP標(biāo)記集在區(qū)分燕麥品種上仍然較大的擴容空間，可繼續(xù)對該SNP集區(qū)分品種的能力進行評估。在今后的工作中，隨著品種數(shù)量的增多、品種指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的進一步豐富，高通量SNP檢測技術(shù)在育成品種的真實性、特異性鑒定方面將具有非常廣闊的應(yīng)用前景。