朱 琳，張維宇，許克新

(北京大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科， 北京 100044)

尿頻、尿急、夜尿、盆腔疼痛這些臨床癥狀極大地影響著膀胱疼痛綜合征患者的生活質(zhì)量，患者大多數(shù)為女性，患病后工作效率低下，睡眠嚴(yán)重不足，經(jīng)常伴發(fā)焦慮、抑郁、性功能障礙等精神心理疾病，在后續(xù)治療中還需要占用許多社會(huì)醫(yī)療資源及投入較大的醫(yī)療服務(wù)成本[1]。為了解決患者的病痛，改善生活質(zhì)量，緩解社會(huì)醫(yī)療資源的壓力，規(guī)范膀胱疼痛綜合征的診斷與治療方法成為當(dāng)前亟待解決的難題，然而目前尚未有統(tǒng)一的臨床診斷與治療標(biāo)準(zhǔn)。

國(guó)際尿失禁協(xié)會(huì)膀胱疼痛綜合征分會(huì)指出，間質(zhì)性膀胱炎(interstitial cystitis，IC)又稱膀胱疼痛綜合征(bladder pain syndrome，BPS)， 是一種與膀胱有關(guān)的不悅感，包括疼痛、壓力、不適感，與下尿路癥狀相關(guān)，持續(xù)時(shí)間超過(guò)6周，無(wú)感染或其他可識(shí)別原因[2]。東亞國(guó)家泌尿外科醫(yī)生提出BPS/IC分為有Hunner潰瘍的BPS/IC患者(BPS/IC with Hunner lesions，HIC)和無(wú)Hunner潰瘍的BPS/IC患者(BPS/IC without Hunner lesions, NHIC), HIC與NHIC膀胱組織學(xué)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種分型對(duì)于診斷、疾病預(yù)后及治療策略的選擇具有重要意義[3-4]。膀胱鏡檢查和組織活檢仍是確診的可靠手段，各地區(qū)診斷方面各有側(cè)重，但逐漸趨歸統(tǒng)一。

BPS/IC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，多數(shù)認(rèn)為與尿路上皮的損傷有關(guān)，糖胺聚糖層的缺失導(dǎo)致膀胱黏膜屏障破壞，膀胱壁滲透性增加，尿液刺激感覺(jué)神經(jīng)引起疼痛[5]，還有學(xué)說(shuō)認(rèn)為肥大細(xì)胞浸潤(rùn)、感染、神經(jīng)系統(tǒng)異常、肌肉功能紊亂及精神心理等因素均與BPS/IC相關(guān)[3, 6]。

目前臨床常規(guī)治療主要有健康教育、口服藥物治療、灌注或注射治療、手術(shù)治療等，健康教育包括改善飲食及行為習(xí)慣、減輕壓力、理療等[7]；口服藥物治療有M受體拮抗劑、α受體阻滯劑、戊聚糖多硫酸酯、環(huán)孢素A[8]、抗菌藥物、鎮(zhèn)痛藥物、精神類藥物等；灌注或注射治療有膀胱灌注二甲基亞砜、透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素、膀胱壁注射肉毒素或類固醇等；手術(shù)治療包括膀胱鏡下水?dāng)U張術(shù)、經(jīng)尿道膀胱電灼術(shù)、骶神經(jīng)刺激術(shù)等，膀胱擴(kuò)大術(shù)、膀胱切除術(shù)、尿流改道術(shù)是治療BPS/IC最終的手段[3, 9]。

為了深入研究BPS/IC的發(fā)病機(jī)制及治療方法，建立簡(jiǎn)便有效的動(dòng)物模型是不可或缺的。Ryu等[10]通過(guò)膀胱內(nèi)滴注硫酸魚(yú)精蛋白以及灌注脂多糖建立大鼠模型，Lv等[11]通過(guò)向大鼠膀胱灌注透明質(zhì)酸酶來(lái)模擬BPS/IC膀胱疼痛的癥狀。腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺也是誘導(dǎo)BPS/IC較為有效的方法，環(huán)磷酰胺代謝物丙烯醛在膀胱特異性蓄積，產(chǎn)生膀胱毒性[12]，誘導(dǎo)BPS/IC表型。de Oliveira等[13]對(duì)C57小鼠單次高劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，24 h后即可誘導(dǎo)BPS/IC的疼痛、組織水腫炎癥等典型表現(xiàn)，Augé等[14]評(píng)估了環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的SD大鼠BPS/IC模型內(nèi)臟疼痛以及膀胱炎癥反應(yīng)水平，指出該模型與人類NHIC非常相似。

以往研究重點(diǎn)關(guān)注動(dòng)物模型的疼痛表型特征，沒(méi)有對(duì)于BPS/IC動(dòng)物模型的尿動(dòng)力學(xué)特征與組織學(xué)的相關(guān)性進(jìn)行分析和評(píng)估。本研究用環(huán)磷酰胺腹腔注射的方法建立SD大鼠BPS/IC模型，從尿動(dòng)力學(xué)與組織學(xué)層面評(píng)估模型的有效性，為BPS/IC的臨床研究奠定動(dòng)物學(xué)基礎(chǔ)，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取8周齡雌性SPF級(jí)SD大鼠32只，體質(zhì)量在250～350 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，控制室溫在21 ℃±3 ℃，給予12 h光照及12 h黑暗規(guī)律交替循環(huán)，自由飲水和進(jìn)食，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)： 2019PHE060)。

32只SD大鼠隨機(jī)分為4組，包括急性實(shí)驗(yàn)組、急性對(duì)照組、慢性實(shí)驗(yàn)組、慢性對(duì)照組，每組8只。急性實(shí)驗(yàn)組在第1天測(cè)完尿動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)后即刻行腹腔注射環(huán)磷酰胺150 mg/kg，第3天后再次行尿動(dòng)力學(xué)檢查，之后處死大鼠，獲取膀胱組織。慢性實(shí)驗(yàn)組第1天測(cè)量尿動(dòng)力基線數(shù)據(jù)后，在第1、4、7天腹腔注射環(huán)磷酰胺75 mg/kg，第8天再次測(cè)量尿動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)后處死大鼠，得到膀胱組織。急性對(duì)照組與慢性對(duì)照組在腹腔注射等量生理鹽水，尿動(dòng)力學(xué)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組一致。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色評(píng)估膀胱炎組織病理學(xué)變化。

1.2 SD大鼠尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)方法

(1)準(zhǔn)備物品：鼠板、氣麻機(jī)、異氟烷、50 mL注射器、防咬手套、輸液泵、碘伏、棉簽、膠布、100 mL無(wú)菌注射鹽水、微型鑷、BL-420N生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)、電腦、壓力傳感器、三通管、泵管等;(2)連接儀器：將電腦與生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)相連接，連接三通管，一端通向19G 膀胱測(cè)壓導(dǎo)管，一端通向輸液泵泵管，一端通向壓力傳感器。連接輸液泵與泵管，排空三通管、傳感器、泵管內(nèi)空氣，設(shè)定輸液泵速度為6 mL/h;(3)麻醉：用異氟烷吸入性麻醉誘導(dǎo)SD大鼠后，將其仰臥位固定于鼠板，再持續(xù)動(dòng)物面罩吸入性麻醉;(4)插管：將大鼠尿道口用碘伏消毒3次，用微型鑷提起尿道，將19G測(cè)壓導(dǎo)管插入尿道進(jìn)入膀胱，插入深度大約3 cm;(5)固定：測(cè)壓管用膠布固定于鼠臺(tái)，防止自行脫出；(6)采集記錄：開(kāi)始灌注生理鹽水，可觀察電腦軟件中采集到尿動(dòng)力曲線圖像，同時(shí)測(cè)壓儀與大氣壓校零后進(jìn)行測(cè)壓，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R (3.6.3版本) 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與可視化，其中R包(主要為 ggplot2，3.3.3版本)用于可視化，符合正態(tài)分布計(jì)量資料的描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式。急性組與慢性組尿動(dòng)力學(xué)基線數(shù)據(jù)的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，單組注射藥物前后尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性分布時(shí)使用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性組與慢性組SD大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)基線

基線數(shù)據(jù)如表1，急性對(duì)照組1只大鼠在麻醉測(cè)量尿動(dòng)力時(shí)意外死亡，因此急性對(duì)照組剩余7只大鼠。

表1 尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)基線數(shù)據(jù)Table 1 Baseline of urodynamic data

2.2 急性實(shí)驗(yàn)組與急性對(duì)照組大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化

急性組給藥前后最大膀胱容量比較結(jié)果顯示，在急性對(duì)照組中，給藥后低于給藥前的平均水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.292,P>0.05，圖1A)；在急性實(shí)驗(yàn)組中，給藥后低于給藥前的平均水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.961,P=0.021，圖1A)。給藥前后最大膀胱壓力結(jié)果顯示，在急性對(duì)照組中，給藥后低于給藥前的平均水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.554,P=0.001，圖1B)；在急性實(shí)驗(yàn)組中，給藥后低于給藥前的平均水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.681,P>0.05，圖1B)。給藥前后膀胱順應(yīng)性結(jié)果顯示，在急性對(duì)照組中，給藥后高于給藥前，變化的差值中位數(shù)為0.013(-0.002,-0.057)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1C)；在急性實(shí)驗(yàn)組中，給藥后低于給藥前，變化的差值中位數(shù)為-0.004(-0.03,-0.013)， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1C)。

2.3 慢性對(duì)照組與慢性實(shí)驗(yàn)組大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

慢性對(duì)照組給藥前后的最大膀胱容量比較顯示，在慢性對(duì)照組中，給藥后低于給藥前的平均水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.029,P>0.05，圖2A)；在慢性實(shí)驗(yàn)組中，給藥后低于給藥前的平均水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.886,P=0.006，圖2A)。最大膀胱內(nèi)壓力比較結(jié)果顯示，在慢性對(duì)照組中，給藥后低于給藥前的平均水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.958,P>0.05，圖2B)；在慢性實(shí)驗(yàn)組中，給藥后低于給藥前的平均水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.544,P>0.05，圖2B)。膀胱順應(yīng)性比較結(jié)果顯示，在慢性對(duì)照組中，給藥后高于給藥前，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2C)；在慢性實(shí)驗(yàn)組中，給藥后低于給藥前，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2C)。

A, comparison of maximum bladder capacity; B, comparison of maximum bladder pressure; C, comparison of bladder compliance; * P<0.05; △P<0.001.圖1 給藥前后急性對(duì)照組與急性實(shí)驗(yàn)組尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較Figure 1 Comparison of urodynamic data between acute control group and acute test group before and after administration

A, comparison of maximum bladder capacity; B, comparison of maximum bladder pressure; C, comparison of bladder compliance; # P<0.01.圖2 給藥前后慢性對(duì)照組與慢性實(shí)驗(yàn)組尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較Figure 2 Comparison of urodynamic data between chronic control group and chronic test group before and after administration

2.4 組織學(xué)評(píng)估

對(duì)急性組SD大鼠膀胱組織進(jìn)行HE染色，鏡下觀察到急性實(shí)驗(yàn)組膀胱組織有膀胱炎癥表現(xiàn)，出現(xiàn)嚴(yán)重的間質(zhì)水腫、明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜水腫和黏膜下出血、部分尿路上皮缺失，而急性對(duì)照組并未觀察到這種改變(圖3、4)。

A, bladder cross section (HE staining ×4); B, normal bladder mucosa (HE staining ×20).圖3 急性對(duì)照組膀胱切片F(xiàn)igure 3 Bladder tissue sections in acute control group

A, bladder cross section (HE staining ×4); B, absence of the urothelium with dense submucosal small blood vessels (HE staining ×20); C, interstitial edema (HE staining ×20).圖4 急性實(shí)驗(yàn)組膀胱切片F(xiàn)igure 4 Bladder tissue sections in acute test group

慢性組大鼠膀胱組織HE染色顯示，慢性實(shí)驗(yàn)組較慢性對(duì)照組出現(xiàn)尿路上皮剝脫現(xiàn)象、間質(zhì)水腫、黏膜下出血明顯、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜下小血管分布密集，而慢性對(duì)照組并無(wú)這種改變(圖5、6)。

3 討論

BPS/IC的病理生理學(xué)機(jī)制一直沒(méi)有明確統(tǒng)一的定論，這對(duì)于BPS/IC的治療樹(shù)立提出了極大的挑戰(zhàn)，探究一種能夠有效模擬BPS/IC的動(dòng)物模型，對(duì)于BPS/IC的機(jī)制研究有著重要的意義。

A, bladder cross section (HE staining ×4); B, normal bladder mucosa (HE staining ×10); C, normal urothelium (HE staining ×20).圖5 慢性對(duì)照組膀胱切片F(xiàn)igure 5 Bladder tissue sections in chronic control group

A, bladder cross section (HE staining ×4); B, submucosal hemorrhage and interstitial edema (HE staining ×10); C, exfoliated urothelium and inflammatory cell infiltration (HE staining ×20).圖6 慢性實(shí)驗(yàn)組膀胱切片F(xiàn)igure 6 Bladder tissue sections in chronic test group

已知的動(dòng)物模型有以膀胱疼痛為中心的用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的，有通過(guò)尾靜脈注射假狂犬病毒激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致神經(jīng)源性膀胱改變的[15]，以及通過(guò)束縛等應(yīng)激情形或注射腎上腺素調(diào)節(jié)環(huán)境溫度、光照等造成動(dòng)物膀胱過(guò)度敏感的等[16]。近年來(lái)，出現(xiàn)了用膀胱尿路上皮抗原或組織勻漿或轉(zhuǎn)基因等方式誘導(dǎo)的BPS/IC的自身免疫性膀胱炎模型(experimental autoimmune cystitis, EAC)[17]，但該模型仍存在較多局限性：(1)所有模型都是由已知或未知的膀胱組織抗原誘導(dǎo)的，但仍然缺乏膀胱組織抗原參與人類 BPS/IC 的直接證據(jù)；(2)HIC膀胱尿路上皮出現(xiàn)剝脫、糜爛或變薄，然而，大多數(shù) EAC 模型顯示尿路上皮增生，這不是具有 Hunner 病變的 BPS/IC 的特征性組織學(xué)特征。還有學(xué)者通過(guò)膀胱灌注透明質(zhì)酸酶或脂多糖等方法進(jìn)行造模[10-11]，這種方式需要多次插尿管，對(duì)插尿管的技術(shù)要求較高，且容易造成尿道損傷。這些模型的造模流程并不統(tǒng)一，結(jié)果也不盡相同，且多為探究神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)通路，并沒(méi)有對(duì)BPS/IC的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行模擬探究和驗(yàn)證。

既往研究已表明，環(huán)磷酰胺的活性代謝產(chǎn)物丙烯醛具有膀胱毒性，通過(guò)腹腔注射能夠誘導(dǎo)膀胱炎模型，使嚙齒類動(dòng)物出現(xiàn)許多BPS/IC的典型疼痛相關(guān)行為，如膀胱逼尿肌不穩(wěn)定以及炎癥表現(xiàn)[18]。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)BPS/IC模型運(yùn)用的是腹腔注射的方法，操作簡(jiǎn)便，避免了造模過(guò)程中膀胱及尿道的損傷性炎癥，并且誘導(dǎo)周期較短，誘導(dǎo)試劑可以根據(jù)體質(zhì)量定量并且容易獲取，疼痛表型也已經(jīng)有過(guò)學(xué)者進(jìn)行驗(yàn)證[16]。雖然這種化學(xué)試劑誘導(dǎo)的膀胱炎癥性改變與BPS/IC的病因及發(fā)病機(jī)制仍具有一定的差異，但目前來(lái)看，該模型誘導(dǎo)快、性價(jià)比高，疼痛癥狀及病理改變較為相似，仍不失為BPS/IC一種理想的動(dòng)物模型。目前，大量研究著重于該動(dòng)物模型的疼痛評(píng)估及神經(jīng)通路的病理變化，而對(duì)于臨床常用的尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)與組織學(xué)特征的關(guān)系卻沒(méi)有深入的研究。本研究通過(guò)單次腹腔注射及3次腹腔注射環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)SD大鼠的急性、慢性膀胱炎模型，探究其尿動(dòng)力學(xué)及組織病理學(xué)特征改變，為BPS/IC的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，單次腹腔注射環(huán)磷酰胺第3天后，大鼠即出現(xiàn)膀胱容量縮小、尿路上皮脫失、黏膜水腫及小血管增生等急性膀胱炎改變，對(duì)于BPS/IC急性發(fā)作的機(jī)制模擬可能具有一定的意義。反復(fù)注射環(huán)磷酰胺的慢性膀胱炎模型中，SD大鼠尿動(dòng)力學(xué)也出現(xiàn)了膀胱容量縮小，但膀胱順應(yīng)性與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在組織學(xué)上可看到明顯的尿路上皮剝脫、黏膜下出血、黏膜水腫、淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。慢性膀胱炎大鼠模型在一定程度上可以模擬BPS/IC的慢性炎癥組織學(xué)表現(xiàn)，但膀胱功能還沒(méi)有受到明顯的損害?？傊?，急性和慢性大鼠模型均更接近于HIC的特征性改變，對(duì)于NHIC的研究應(yīng)采用其他更接近的動(dòng)物模型。