劉碧玉 周偉靚 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心 福州 350003

氟苯尼考（Forfenicol，F(xiàn)F）是廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的酰胺醇類藥物，因氟苯尼考與多西環(huán)素（DOX）的復(fù)方制劑經(jīng)臨床試驗(yàn)證明可顯著提高禽類養(yǎng)殖過(guò)程中生存質(zhì)量及存活率， 增加養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)效益。 目前， 檢測(cè)禽類肌肉中氟苯尼考藥物殘留的方法主要有高效液相色譜熒光檢測(cè)法、 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法。 由于酶聯(lián)免疫法僅適用于初篩和快檢，基于氟苯尼考?xì)埩舸_證定量檢測(cè)，本試驗(yàn)以擬建立的高效液相色譜熒光檢測(cè)法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為禽類肌肉質(zhì)量控制 （氟苯尼考?xì)埩簦┨峁┗A(chǔ)支撐。

1 材料和方法

1.1 高效液相色譜熒光檢測(cè)法

1.1.1 儀器和試劑 2695 高效液相色譜儀，沃特世Waters 科技有限公司；ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱，沃特世Waters 科技有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；AR3130 電子天平，奧豪斯（上海公司）；D-37520 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)科俊儀器有限公司；N-EVAP 112 氮吹儀，美國(guó)Organomation 有限公司；MS3 digital 渦旋混勻器，德國(guó)IKA 有限公司。 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，含量為99.8%，購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer 公司； 優(yōu)級(jí)純甲醇、 色譜純乙腈、色譜純正己烷，均購(gòu)自默克股份兩合公司；分析純乙酸乙酯，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜純甲酸，美國(guó)阿拉丁工業(yè)公司。

1.1.2 檢測(cè)方法與步驟

1.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 稱取氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精密稱定，標(biāo)準(zhǔn)品含量為99.8%），置100 mL棕色容量瓶中， 加色譜純乙腈定容至刻度， 配制成100 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-20 ℃冰箱保存。

取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100 mL 棕色容量瓶中，用色譜純乙腈定容至刻度，配制成1 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，-20 ℃冰箱保存。

取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于10 mL 棕色容量瓶中，用色譜純乙腈定容至刻度，配制成100 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用前現(xiàn)配。

1.1.2.2 樣品中氟苯尼考有效成分提取 稱取2.0 g（精確到0.001 g） 均質(zhì)的禽肉樣品于50 mL 離心管中，加色譜純乙腈15 mL，加入一顆均勻子，渦動(dòng)提取1 min，8 000 r/min 離心5 min， 提取液轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，重復(fù)提取一次，合并提取液，50 ℃下氮吹近干，加2 mL 水使殘?jiān)芙?，加? mL 色譜純正己烷， 渦旋提取1 min， 靜置分層或8 000 r/min 離心5 min，棄掉上層的正己烷層，再加5 mL 色譜純正己烷， 渦旋提取1 min， 靜置分層或8 000 r/min 離心5 min，棄掉上層的正己烷層，取下層清液過(guò)0.22 μm 濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.1.2.3 高效液相色譜條件 BEH -C18 柱（2.1 mm× 150 mm，5 μm）或相當(dāng)者；流動(dòng)相：水:甲醇=75:35； 流速：1 mL/min； 柱溫：40 ℃； 進(jìn)樣量：10 μL；測(cè)定波長(zhǎng)：230 nm。

1.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1.2.1 儀器和試劑 超高效液相色譜/氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，Waters 沃特世科技（上海）有限公司；Waters TQ-S UPLC/MS/MS BEH-C18 柱，Waters 科 技有限公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；AR3130 電子天平，奧豪斯（上海公司）；D-37520 高速冷凍離心機(jī)， 美國(guó)科俊儀器有限公司； N-EVAP 112 氮吹儀， 美國(guó)Organomation 有限公司；MS3 digital 渦旋混勻器， 德國(guó)IKA 有限公司。 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品， 含量為99.8%， 購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer 公司；優(yōu)級(jí)純甲醇、乙腈、正己烷，均購(gòu)自默克股份兩合公司；分析純乙酸乙酯，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 優(yōu)級(jí)純甲酸， 美國(guó)阿拉丁工業(yè)公司。

1.2.2 試驗(yàn)方法與步驟

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 （同高效液相色方法）0.1 mL，置100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到1 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。 精密量取1 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到100 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取5.0 g （精確至0.01 g）均質(zhì)的禽肉或禽蛋樣品于50 mL 離心管中，加入15 mL 乙酸乙酯和0.5 mL 氨水， 渦旋提取1 min，8 000 r/min 離 心5 min， 上 清 液 轉(zhuǎn) 入 另 一50 mL 離心管中； 重復(fù)提取一次， 離心后合并上清液，取6 mL 上清液到15 mL 離心管中，50 ℃氮吹近干，待凈化。

用1 mL 0.5%甲酸乙腈/水溶液復(fù)溶，渦旋30 s，加入5 mL 飽和正己烷，渦旋1 min，棄去上層正己烷；重復(fù)操作3 次，取下層清液過(guò)0.22 μm 濾膜后上機(jī)測(cè)定。 同法做樣品空白試驗(yàn)。

1.2.2.3 質(zhì)譜條件 掃描方式： 多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源：電噴霧離子源（ES+）；離子源溫度：150 ℃； 離子源噴霧電壓：3.0 kV ES+； 霧化溫度：550 ℃；霧化氣流速：900 L/h；錐孔氣流速：150 L/h。

2 結(jié)果與對(duì)比分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別量取（1 00 ng/mL） 標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.00 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中， 用流動(dòng)相定容至刻度，混勻， 配 制 成 濃 度 為0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 和200 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1-圖2）。 在樣品中添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液， 按HPLC 和LC-MS/MS 方法要求進(jìn)行樣品前處理，分別上高效液相色譜儀和超高效液相色譜/氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，按稱樣量計(jì)，對(duì)相應(yīng)濃度定量限進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限，從表1 可見(jiàn)， 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液在5～200 ng/mL 具有良好的線性關(guān)系， 高效液相色譜熒光檢測(cè)法相關(guān)系數(shù)為0.9993， 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相關(guān)系數(shù)為0.9991；高效液相色譜熒光法檢出限為10 μg/kg、 定量限30 μg/kg，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢出限為5 μg/kg、定量限10 μg/kg， 高效液相色譜熒光檢測(cè)法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法均能達(dá)到氟苯尼考?xì)埩魴z測(cè)要求。

圖1 HPLC 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 LC-MS/MS 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

表2 平行測(cè)定樣品的加標(biāo)回收率

2.2 樣品檢測(cè)和加標(biāo)回收率 選取市售鴨肉、雞肉各一份， 按照高效液相色譜熒光檢測(cè)法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行樣品處理、測(cè)定，均未檢出氟苯尼考?xì)埩?。按方法要求稱取樣品，分別加入5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg 標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平做6 個(gè)平行測(cè)定， 按照兩種方法要求進(jìn)行樣品前處理、測(cè)定，從表2 可見(jiàn)，高效液相色譜熒光檢測(cè)法的樣品加標(biāo)回收率為82.0%～92.0%，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為90.0%～100.0%；高效液相色譜熒光檢測(cè)法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.34%～3.78%， 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為1.95%～3.68%。 可見(jiàn)，高效液相色譜熒光檢測(cè)法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相關(guān)試驗(yàn)表現(xiàn)均符合氟苯尼考藥物殘留檢測(cè)要求。

3 結(jié) 論

高效液相色譜熒光檢測(cè)法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的樣品加標(biāo)回收率分別為82.0%～92.0%、90.0%～100.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，達(dá)到相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求，適用于氟苯尼考在禽類肌肉藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究。 高效液相色譜儀已較為普及，禽類肌肉樣品處理操作工序相近的情況下，使用高效液相色譜熒光檢測(cè)法，干擾因素較少，在不具備液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法試驗(yàn)條件的地區(qū)或單位，高效液相色譜熒光檢測(cè)法的試驗(yàn)結(jié)果同樣具有參考價(jià)值， 為檢驗(yàn)條件相對(duì)落后的地區(qū)或單位在畜牧業(yè)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)及其他應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)性試驗(yàn)支撐。