袁 夢(mèng) 黃慧清 陳 瀾 朱錦平 馬燕梅

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院） 福州 350002)

2020 年7 月1 日飼料抗生素全面禁用以來(lái)，天然飼料添加劑得到了廣泛關(guān)注。酸化劑作為高效、無(wú)殘留、無(wú)副作用的添加劑，在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)方面有著較為顯著的作用，是一種常見(jiàn)的飼料添加劑。酸化劑種類很多，主要分為單一酸化劑（無(wú)機(jī)酸化劑與有機(jī)酸化劑）和復(fù)合酸化劑兩種。 隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，有機(jī)酸添加劑在畜禽生產(chǎn)上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛， 其中檸檬酸的應(yīng)用較為普遍。 檸檬酸可以掩蓋飼料中因添加礦物質(zhì)、維生素等引發(fā)的不良?xì)馕?，起到調(diào)節(jié)飼料風(fēng)味的作用，從而改善日糧的適口性。 周夢(mèng)佳等[1]研究表明，有機(jī)酸可以提升腸道消化吸收能力，為腸道提供適宜的酸度， 使無(wú)活性的胃蛋白酶原轉(zhuǎn)化為有活性的胃蛋白酶，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。酸化劑可以提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。 劉新澤等[2]報(bào)道復(fù)合酸化劑可以顯著提高血清免疫球蛋白含量， 從而提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，進(jìn)一步改善生產(chǎn)性能。有機(jī)酸還可以改善腸道微生態(tài)， 攝入有機(jī)酸后偏酸性的微環(huán)境對(duì)大腸桿菌等病原菌的生長(zhǎng)繁殖起到了抑制作用，為胃腸道提供健康的環(huán)境。 研究表明，酸化劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌、標(biāo)準(zhǔn)沙門(mén)氏菌及臨床分離大腸桿菌均具有不同程度的抑菌作用[3]。曾子悠等[4]報(bào)道飼糧添加植物精油和酸化劑組合可以提高麻黃肉雞生長(zhǎng)性能，改善免疫器官指數(shù)、空腸形態(tài)和肉品質(zhì)。 沈一茹等[5]試驗(yàn)表明飼糧中添加酸化劑可以顯著提高腸道絨毛隱窩比及杯狀細(xì)胞數(shù)量， 進(jìn)一步改善肉雞生長(zhǎng)性能和腸道發(fā)育。 本研究通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)和消化道平滑肌收縮試驗(yàn)， 并給小鼠飼喂不同濃度的檸檬酸溶液， 探究檸檬酸促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)及提高機(jī)體消化功能的機(jī)制， 為飼料酸化劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 6~8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠和2.0±0.02 kg 普通家兔，均購(gòu)自閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司。

1.2 主要試劑 胃蛋白酶測(cè)定試劑盒 （比色法）和胰蛋白酶測(cè)定試劑盒（比色法）購(gòu)自南京建成生物工程 研 究 所；TRYPTONE、YEAST EXTRACT、Agar 購(gòu)自O(shè)XOID 公司；頭孢噻肟、強(qiáng)力霉素、多粘菌素B、青霉素、 阿莫西林藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 檸檬酸抑菌試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)置1 個(gè)對(duì)照組和2 個(gè)試驗(yàn)組，均使用固體LB 瓊脂培養(yǎng)基。 對(duì)照組使用商品化頭孢噻肟、強(qiáng)力霉素、多粘菌素B、青霉素、阿莫西林藥敏片， 試驗(yàn)組1 接種大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25922）， 試 驗(yàn) 組2 接 種 葡 萄 球 菌 標(biāo) 準(zhǔn) 株（ATCC 25923）， 各試驗(yàn)組使用不同檸檬酸濃度（0%、1%、5%、10%和15%）的自制試紙片，測(cè)量并比較檸檬酸抑菌圈和五種常用抗生素抑菌圈的直徑。

1.4 離體腸道平滑肌收縮試驗(yàn) 試驗(yàn)前將小鼠和兔禁食數(shù)小時(shí)后處死并立即剖開(kāi)腹腔， 找到胃幽門(mén)和十二指腸交界處，以此為起點(diǎn)取長(zhǎng)20~30 cm 的腸管，迅速將標(biāo)本放入臺(tái)氏液中，并用臺(tái)氏液沖洗腸腔內(nèi)容物。 沖洗干凈后，將腸管剪成數(shù)段，每段長(zhǎng)2~3 cm，置于臺(tái)氏液中備用。 使用BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)定不同濃度檸檬酸對(duì)離體腸道平滑肌的收縮頻率（次/min）和收縮強(qiáng)度，計(jì)算腸管的腸道活動(dòng)力（腸道活動(dòng)力=平均強(qiáng)度×頻率， 單位：g·次數(shù)/min）。

1.5 檸檬酸對(duì)小鼠生長(zhǎng)與消化功能的影響 選擇20 只體重相近的6 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠飼養(yǎng)于EVC 鼠籠，分為5 組：對(duì)照組和4 組試驗(yàn)組，每組4 只小鼠，對(duì)照組正常飲水，試驗(yàn)組分別飼喂檸檬酸濃度為0.05 g/L、0.1 g/L、0.15 g/L 和0.2 g/L 的飲用水。 飼養(yǎng)周期14 d，每3 d 稱量小鼠體重，以飼養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)、 體重差值為縱坐標(biāo)繪制小鼠體重生長(zhǎng)曲線。

第14 d， 采用摘除眼球采血法采集小鼠全血1 mL， 在37 ℃溫箱靜置30 min 后8 000×g 常溫離心5 min，取血清。 處死小鼠并立即剖取胃、小腸，并分別收集內(nèi)容物至滅菌EP 管。 按照胃蛋白酶和胰蛋白酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，分別檢測(cè)血清、胃內(nèi)容物和小腸內(nèi)容物消化酶活性。

剖14 d 小鼠， 取1 cm 空腸用1×PBS 沖洗后用固定液固定24 h，將固定好的腸管組織送至武漢塞維爾公司委托其制作HE 組織切片并掃描。 運(yùn)用CaseViewer 軟件測(cè)量每個(gè)樣本的絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度并計(jì)算絨毛與隱窩的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果 由表1-表2 可知，檸檬酸對(duì)大腸桿菌和葡萄球菌均有抑制作用， 隨著檸檬酸濃度增加，其抑菌效果也遞加。 對(duì)于大腸桿菌，10%檸檬酸的抑菌效果與阿莫西林抑菌效果相似，15%檸檬酸的抑菌效果與頭孢噻肟相似。 對(duì)于葡萄球菌，10%檸檬酸抑菌效果與多西環(huán)素抑菌效果相似，15%檸檬酸的抑菌效果與阿莫西林相似。

表1 檸檬酸對(duì)大腸桿菌的抑制作用

表2 檸檬酸對(duì)葡萄球菌的抑制作用

2.2 平滑肌收縮試驗(yàn)結(jié)果 在離體腸道平滑肌收縮試驗(yàn)中，由圖1、圖2 可知，檸檬酸濃度為0.1 g/L和0.15 g/L 時(shí)， 隨著檸檬酸濃度升高鼠腸道活動(dòng)力越高， 當(dāng)檸檬酸濃度達(dá)到0.1 g/L 和0.15 g/L 時(shí)，鼠腸道活動(dòng)力極顯著提高（P＜0.01）。 由圖3、圖4 可知，檸檬酸濃度為0.1 g/L 和0.15 g/L 時(shí)，隨著檸檬酸濃度升高兔腸道活動(dòng)力越高， 當(dāng)檸檬酸濃度達(dá)到0.1 g/L 和0.15 g/L 時(shí)， 兔腸道活動(dòng)力極顯著提高（P＜0.01）。

圖1 檸檬酸對(duì)鼠腸道平滑肌收縮影響波形圖

圖2 檸檬酸對(duì)鼠腸道活力的影響

圖3 檸檬酸對(duì)兔腸道平滑肌收縮影響波形圖

圖4 檸檬酸對(duì)兔腸道活力的影響

2.3 檸檬酸對(duì)小鼠生長(zhǎng)與消化功能的影響 圖5結(jié)果顯示，隨著時(shí)間推移，小鼠體重不斷增加，與對(duì)照組相比，檸檬酸濃度為0.1 g/L 時(shí)，小鼠14 d 體重差值最高。

圖5 檸檬酸對(duì)小鼠的生長(zhǎng)影響

消化酶活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7 和圖8。 與對(duì)照組相比，0.1 g/L 濃度組胃蛋白酶活力和血清胰蛋白酶活力有增長(zhǎng)趨勢(shì)。 腸內(nèi)容物胰蛋白酶活力結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，0.1 g/L 濃度組極顯著提高（P＜0.01），0.15 g/L 濃度組顯著提高（P＜0.05）。

圖6 檸檬酸對(duì)胃蛋白酶活性的影響

圖7 檸檬酸對(duì)血清胰蛋白酶活性的影響

圖8 檸檬酸對(duì)腸胰蛋白酶活性的影響

由圖9 可知， 與對(duì)照組相比， 檸檬酸濃度達(dá)到0.1 g/L 和0.15 g/L 時(shí)， 小腸絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度比值極顯著增高（P＜0.01）。

3 討 論

圖9 檸檬酸對(duì)腸絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度比值的影響

3.1 檸檬酸的抑菌作用 本試驗(yàn)選擇革蘭氏陽(yáng)性菌葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌進(jìn)行檸檬酸抑菌圈試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度檸檬酸對(duì)大腸桿菌和葡萄球菌的生長(zhǎng)均有抑制效果， 隨著檸檬酸濃度增加，抑菌效果越好。 大腸桿菌培養(yǎng)基中15%濃度檸檬酸的抑菌效果與頭孢噻肟相當(dāng)， 葡萄球菌培養(yǎng)基中15%濃度檸檬酸的抑菌效果與阿莫西林相當(dāng)。 朱愛(ài)民等[6]研究發(fā)現(xiàn)酸化劑處理斷乳仔豬能使其糞便中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌顯著降低。除此之外，孫建華等[7]研究發(fā)現(xiàn)酸化劑不僅能顯著降低腸道有害菌的數(shù)量， 而且能顯著提高腸道有益菌乳酸桿菌的數(shù)量。 鄭建婷等[8]試驗(yàn)得出飼糧中添加檸檬酸能增加優(yōu)勢(shì)菌屬的種類，從而提高微生物多樣性。

3.2 檸檬酸對(duì)腸道平滑肌收縮功能的影響 腸道的消化吸收能力與腸道平滑肌的收縮功能密切相關(guān)。 本試驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，含0.1 g/L和0.15 g/L 檸檬酸的臺(tái)氏液環(huán)境能極顯著提高鼠與兔的腸道活動(dòng)力。 適當(dāng)?shù)腍+濃度促進(jìn)鈣通道激活，肌纖蛋白對(duì)Ca2+敏感性升高，肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+增多，故平滑肌收縮力加強(qiáng)[9]，檸檬酸添加濃度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均會(huì)改變腸道活動(dòng)力。

3.3 檸檬酸對(duì)物質(zhì)代謝與營(yíng)養(yǎng)功能的影響

3.3.1 檸檬酸對(duì)生長(zhǎng)性能的影響 在飲水或飼料中添加適量的檸檬酸，能提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬酸能提高小鼠的增重，促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)，以飲水中添加0.1 g/L 檸檬酸效果最佳。 Liao 等[10]報(bào)道在15～35 日齡肉鴨飲水中添加檸檬酸(0.068%)不僅能降低大腸桿菌數(shù)量，還可提高肉鴨采食量，從而達(dá)到提高生長(zhǎng)性能的目的。 在飼料中添加檸檬酸不僅能提高腸道消化吸收能力，還能改善日糧適口性。池仕紅等[11]研究表明不同種類的酸化劑均能提高斷乳仔豬生長(zhǎng)性能。 何榮香等[12]通過(guò)試驗(yàn)證明在斷乳仔豬飼糧和飲水中單獨(dú)或組合添加有機(jī)酸均可提高斷乳仔豬的生長(zhǎng)性能。大量研究表明，檸檬酸可以提高動(dòng)物采食量， 提高其生長(zhǎng)性能， 促進(jìn)動(dòng)物健康成長(zhǎng)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.3.2 檸檬酸對(duì)消化酶活性的影響 pH 是影響消化道酶活性的重要因素之一， 消化酶在偏酸性的環(huán)境中發(fā)揮作用更強(qiáng)，尤其是胃蛋白酶，檸檬酸能促進(jìn)無(wú)活性的胃蛋白酶原轉(zhuǎn)化為具有活性的蛋白酶，以有效水解蛋白質(zhì)[13]。 本試驗(yàn)表明檸檬酸可以提高胃蛋白酶和血清蛋白酶活性， 但不同濃度組別間差異不顯著。我們研究發(fā)現(xiàn)飼喂檸檬酸濃度0.1 g/L 飲用水的小鼠，其腸內(nèi)容物胰蛋白酶活性極顯著提高。與孫建華等[7]研究?jī)煞N復(fù)合酸化劑對(duì)肉雞胃蛋白酶、胰蛋白酶活性的影響結(jié)果相似。

3.3.3 檸檬酸對(duì)小腸黏膜形態(tài)及絨毛隱窩比的影響小腸是動(dòng)物機(jī)體進(jìn)行消化吸收的主要場(chǎng)所。 良好的小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)促進(jìn)腸道生理功能有重要的作用。 小腸絨毛加長(zhǎng)，隱窩加深，可使小腸與食糜接觸的面積增加，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，檸檬酸濃度為0.1 g/L 和0.15 g/L的試驗(yàn)組，小腸絨毛隱窩比極顯著提高。程卓等[14]研究檸檬酸對(duì)草魚(yú)腸道組織形態(tài)影響， 發(fā)現(xiàn)添加0.15%～0.45%檸檬酸的草魚(yú)腸道絨毛高度顯著提高。 王慶爭(zhēng)等[15]研究表明0.1%酸化劑在與血漿蛋白粉合用情況下能使28 日齡、35 日齡仔兔的十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度顯著增加，隱窩深度顯著降低。

4 結(jié) 論

檸檬酸有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)及提高消化功能的作用，主要通過(guò)抑制有害菌的生長(zhǎng)、提高消化道平滑肌的收縮強(qiáng)度及頻率、 促進(jìn)消化酶活性及改善腸道黏膜形態(tài)、 增大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收面積來(lái)實(shí)現(xiàn)。 綜合本試驗(yàn)結(jié)果， 以添加檸檬酸濃度為0.1 g/L 和0.15 g/L 效果較好。