洪 淵 韓云珍 薛永欽 薛宏烽 邱定杰 王秀愛 阮國榮＊

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 福州 350119；2.福建省永誠華多種豬有限公司 福州 350319）

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）F4ac 是造成斷乳前仔豬腹瀉的主要病原菌之一， 給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。 豬13 號(hào)染色體的MUC13 基因已確定是控制仔豬ETEC F4ac 易感或抗性的主效基因，其CDS 序列908 位堿基A 突變?yōu)镚 時(shí)，可降低斷乳前仔豬腹瀉易感性[3-4]。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步， 分子標(biāo)記選擇在種豬育種中的運(yùn)用已逐步普及，MUC13 抗腹瀉純合基因型頻率不斷提高，仔豬抗腹瀉基因純合時(shí)是否會(huì)影響其生產(chǎn)性狀是大家比較關(guān)心的問題。已有研究表明，在杜洛克、大白、皮特蘭以及部分中國地方豬種群體中，MUC13 抗性基因純合對生產(chǎn)性狀無顯著影響， 對部分品種在生長速度上略有優(yōu)勢，但差異不顯著[5-7]。 在長白群體中MUC13 基因是否對生產(chǎn)性狀有影響， 該基因?qū)ιa(chǎn)性狀的影響是否存在品種差異仍未有定論。 因此， 本研究通過檢測134 頭美系長白群體MUC13基因的多態(tài)性，并與生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為選育MUC13 抗性純合長白豬群提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 本試驗(yàn)以貴州永誠引種的第三批長白原種豬為研究對象，群體數(shù)量為134 頭，其中母豬126 頭，公豬8 頭。 測定134 頭長白豬（150±5）日齡時(shí)的體重、 背膘厚、 眼肌面積等性狀， 并利用Herdsman 軟件計(jì)算日增重、瘦肉率。 采集的試驗(yàn)群體耳組織均置于75%酒精中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑 Veriti 96 孔熱循環(huán)儀（4375786， 美 國Thermo Fisher ScientificoApplied Biosystems）；凝膠成像系統(tǒng)（GelDocIt 310，美國UVP）；電泳儀（DYY-7C，北京六一）；血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304，北京天根）；2×Taq PCR Mastermix（KT201，北京天根）。

1.3 MUC13 基因型檢測

1.3.1 DNA 提取 采用血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒，從豬耳組織樣品中提取DNA，統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物合成 MUC13 基因位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增引物序列見表1，引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增與基因型判定 MUC13 基因的PCR 引物擴(kuò)增體系為25 μL：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，引物Fp、引物Rp 各1 μL，基因組DNA 模板1.5 μL，ddH2O 9 μL。 PCR 的反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

PCR 產(chǎn)物送通用生物進(jìn)行Sanger 測序， 采用SeqMan 軟件對MUC13 基因的測序結(jié)果進(jìn)行判定（見圖1），根據(jù)等位基因分別判定為AA 型、AG 型、GG 型。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用EXCEL 分析長白豬群體MUC13 基因的等位基因頻率及基因型頻率。經(jīng)前期雙因素方差分析（Two-way ANOVA），兩個(gè)基因?qū)ιa(chǎn)性狀的影響均未表現(xiàn)出性別差異， 故采用SPSS 19.0 軟件中的單因素方差分析（One-Way ANOVA）計(jì)算MUC13 基因不同基因型與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果用平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Duncan 檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異顯著性分析，當(dāng)P<0.05 時(shí)差異顯著。

1.4 生產(chǎn)性能測定 將豬只飼養(yǎng)至100 kg 左右時(shí)進(jìn)行稱重， 同時(shí)利用ALOKA 500 B 超儀進(jìn)行活體背膘測量，所測數(shù)據(jù)錄入Herdsman 育種軟件，校正到達(dá)114 kg 體重時(shí)的眼肌面積和背膘厚，同時(shí)用軟件計(jì)算瘦肉率。

圖1 MUC13 基因的測序結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 長白豬MUC13 基因的基因型頻率和等位基因頻率 長白豬群體MUC13 基因型頻率和等位基因頻率見表2，GG、AG、AA 三種基因型分布頻率分別為0.731、0.246、0.022， 優(yōu)勢等位基因G 的頻率為0.854，劣勢等位基因A 的頻率為0.146，其分布不符合HWE 平衡（P=0.003）。

2.2 長白豬MUC13 基因型與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)性MUC13 基因不同基因型與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果見表3。 MUC13 基因不同基因型對體重、日增重、背膘厚、瘦肉率等性狀有顯著影響（P<0.05），對眼肌面積性狀影響不顯著（P>0.05）。GG、AG 基因型在體重、 日增重性狀上顯著優(yōu)于AA 基因型 （P<0.05），但背膘偏厚、瘦肉率偏低（P<0.05）。

表1 MUC13 基因引物設(shè)計(jì)

表2 MUC13 基因的基因型頻率和等位基因頻率

表3 MUC13 基因不同基因型與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討論與結(jié)論

本研究對134 頭美系長白豬MUC13 基因型進(jìn)行檢測， 結(jié)果表明：GG、AG、AA 三種基因型分布頻率分別為0.731、0.246、0.022，優(yōu)勢等位基因G 的頻率為0.854，劣勢等位基因的頻率為0.146，其分布不符合HWE 平衡（P=0.003），說明前期在兼顧表型選擇和性能測定的前提下所開展的抗腹瀉選育效果良好，優(yōu)勢等位基因G 逐漸純合。

MUC13 基因型與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析表明，該基因在美系長白群體中對生產(chǎn)性狀有顯著影響。 其中，優(yōu)勢等位基因G 可顯著提高生長速度，GG 基因型個(gè)體在體重、 日增重性狀上較AA 基因型分別增加12.14 kg 和0.08 kg，由此可推測豬只在生長過程中因缺乏產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）F4ac 受體而減少了腹瀉的概率，增加了豬群的健康度，從而提高了生長速度。 GG 抗腹瀉優(yōu)勢基因型在背膘厚性狀上較AA 基因型增加了6.02 mm， 在瘦肉率性狀上較AA 基因型減少了0.02， 在這兩個(gè)性狀上表現(xiàn)出輕微劣勢。隨著居民消費(fèi)水平不斷提高，人們對于豬肉的消費(fèi)觀念發(fā)生了變化， 逐漸開始關(guān)注肉質(zhì)而沒有一味強(qiáng)調(diào)瘦肉率， 所以綜合考慮MUC13 基因?qū)ιa(chǎn)性狀的影響， 在選育過程中逐漸增加優(yōu)勢等位基因G 的頻率來提升抗腹瀉能力和生長速度仍是必然趨勢。

本試驗(yàn)豬群體的劣勢等位基因A 頻率較低，劣勢等位基因型AA 個(gè)體數(shù)量更少，代表性相對較弱，有待于擴(kuò)大檢測和性能測定群體以進(jìn)一步驗(yàn)證；試驗(yàn)僅對體重、日增重、背膘厚、眼肌面積、瘦肉率等性狀進(jìn)行比較分析， 至于對其余生產(chǎn)性能指標(biāo)及肉質(zhì)性狀等有無影響，也有待后續(xù)試驗(yàn)加以研究。

綜上所述， 美系長白豬群MUC13 抗性有利基因頻率較高，在兼顧體型外貌及性能測定的前提下，通過對抗腹瀉優(yōu)勢基因型GG 的選留， 既可降低仔豬腹瀉率，又可提高豬群生長速度，是培育“長速快”長白豬種群的有效舉措。