周曉馥，劉美琦，金妍，徐洪偉*

(1.吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000；2.吉林師范大學(xué) 吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 四平 136000)

0 引言

玉米(ZeamaysL.)占據(jù)世界糧食總產(chǎn)量的第一位，同時(shí)玉米也是重要的工業(yè)原料及飼料.但實(shí)際生產(chǎn)中玉米會因受到諸多不利因素導(dǎo)致產(chǎn)量大大降低，如干旱、低溫、鹽脅迫等[1].MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，MYB蛋白在抵抗非生物脅迫調(diào)控中有重要作用.對玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行功能分類和分析鑒定，可為玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的抗旱功能研究奠定基礎(chǔ)，為研究玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白應(yīng)答干旱脅迫提供重要借鑒.MYB轉(zhuǎn)錄因子，在植物中家族成員數(shù)量較多，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(ZeamaysL.)和水稻(OryzasativaL.)中MYB類轉(zhuǎn)錄因子各有168、203和130個(gè)[2].MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員都具有高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域.通常根據(jù)其所包含的MYB結(jié)構(gòu)域的重復(fù)數(shù)量將MYB類轉(zhuǎn)錄因子分為MYB-related、R2R3-MYB(2R-MYB)、3R-MYB和4R-MYB四類，R2R3-MYB類蛋白在其N端含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端含有激活或抑制結(jié)構(gòu)域，其參與植物生長發(fā)育、代謝、脅迫以及代謝等生理機(jī)制的調(diào)節(jié)[3-4].目前MYB轉(zhuǎn)錄因子家族已被證明參加了植物對干旱的應(yīng)答[5]，研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎麥中的FtMYB9過表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性[6]，苦蕎麥FtMYB13可以提高擬南芥的耐鹽和耐旱性[7]，大麥轉(zhuǎn)錄因子HvMYB1是耐旱性的正調(diào)控因子[8]，玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子ZmMYB3R的表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植株的干旱和鹽脅迫耐受性[9]，楊樹中的PtrMYB94與ABA信號協(xié)同作用，可以提高植物的抗旱性[10].由于玉米作為人類賴以生存的重要糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)受種植區(qū)域干旱脅迫的影響較為嚴(yán)重.通過挖掘應(yīng)答干旱脅迫的玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子，分析其蛋白結(jié)構(gòu)，可為揭示玉米抗旱功能分析奠定基礎(chǔ).本研究通過對玉米和擬南芥中具有抗脅迫功能的MYB家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)而預(yù)測玉米中與抗旱功能有關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，為闡明玉米轉(zhuǎn)錄因子MYB家族應(yīng)對干旱脅迫的功能奠定一定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子的獲取和鑒定

從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB(planttfdb.gao-lab.org)上搜索玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子，并下載所有的氨基酸序列.隨后使用Pfam(http：//pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行MYB結(jié)構(gòu)域的識別，將得到的玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子分類并匯總記錄.擬南芥的R2R3-MYB和MYB-related成員主要從TAIR數(shù)據(jù)庫中下載獲得.

1.2 玉米MYB蛋白理化性質(zhì)分析

從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中獲得玉米MYB蛋白的理化性質(zhì)，包括氨基酸(aa)、相對分子質(zhì)量(MW)、等電點(diǎn)(PI)、功能等信息.

1.3 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守基序預(yù)測

為了研究蛋白序列中除MYB重復(fù)以外的保守基序，利用MEME在線軟件(http：//memsuite.org/index.html)分析玉米MYB蛋白全長序列，隨后用TBtools軟件進(jìn)行保守基序可視化分析.

1.4 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為了研究玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子抗旱蛋白的結(jié)構(gòu)域，基于玉米具有抗旱功能的MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白全長序列，通過TBtools軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域可視化分析.

1.5 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白亞細(xì)胞定位

對玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子抗旱蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，使用ProtComp進(jìn)行分析，獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)定位結(jié)果.

1.6 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA在線軟件預(yù)測玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子抗旱蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODLE對其進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測.

1.7 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能預(yù)測

為了預(yù)測玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的功能，采用MUSCLE對玉米MYB序列與擬南芥MYB序列進(jìn)行多序列比對，借助于MEGA11.0軟件將玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建.

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子鑒定

利用PlantTFDB數(shù)據(jù)庫，通過關(guān)鍵詞“MYB”和“Zeamays”獲得203個(gè)玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子，如表1所示.依據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域重復(fù)數(shù)目的不同，將其分為五類：MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB及5R-MYB.其中，數(shù)量最多的是R2R3-MYB類，有176個(gè)，占總數(shù)的86.7%.根據(jù)玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的命名方法，命名為Zm2RMYB1-Zm2RMYB176.其次為MYB-related類，有20個(gè)，命名為Zm1RMYB1-Zm1RMYB20.3R-MYB類有6個(gè)，命名為Zm4RMYB1-Zm4RMYB6.5R-MYB類只有1個(gè)，命名為Zm5RMYB1.為了解玉米MYB蛋白的特點(diǎn)，分析了玉米MYB的蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果如表1所示：玉米MYB蛋白編碼188～1 060個(gè)氨基酸；玉米MYB蛋白家族的相對分子質(zhì)量在20 693.7～117 692 kD之間；玉米MYB蛋白家族的等電點(diǎn)在4.297 7～12.297 4之間.

表1 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子的分類及性質(zhì)

2.2 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守基序分析

為了解玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了玉米203個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹，如圖1所示.玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYB類聚在一起，其中有少數(shù)的MYB-related類與R2R3-related類聚集在一起.為進(jìn)一步了解玉米MYB蛋白結(jié)構(gòu)，通過在線軟件MEME對玉米MYB蛋白的保守基序進(jìn)行預(yù)測，利用TBtools 軟件獲得結(jié)果圖2.由圖可知，玉米的四類MYB轉(zhuǎn)錄因子中存在的Motif有差異，通常同一類MYB轉(zhuǎn)錄因子中Motif的分布情況較相似.R2R3-MYB 類蛋白均共享Motif 1、Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif6和Motif 8.3R-MYB類蛋白均共享Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 10.5R-MYB類蛋白中含有3個(gè)Motif 1.MYB-related類蛋白均含有Motif 2和Motif 3.在R2R3-MYB類蛋白中，Motif在每個(gè)基因上的相對位置是一致的，說明Motif并非隨機(jī)出現(xiàn)，而是具有一定的保守性.

圖1 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹

圖2 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守基序

2.3 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能預(yù)測

為對玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行功能預(yù)測，將176個(gè)R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子和20個(gè)MYB-related類轉(zhuǎn)錄因子分別與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多序列對比，利用MAGE11.0構(gòu)建進(jìn)化樹得到結(jié)果圖3和圖4.根據(jù)擬南芥R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子劃分的功能群，對玉米R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的功能進(jìn)行預(yù)測，玉米R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子可能與植物細(xì)胞的發(fā)育、植物雄性生殖器和莖的發(fā)育、植物苯丙烷類次生代謝途徑的調(diào)節(jié)、植物非脅迫調(diào)節(jié)有關(guān).以擬南芥MYB-related類轉(zhuǎn)錄因子的分類為依據(jù)，部分?jǐn)M南芥中的轉(zhuǎn)錄因子在玉米中沒有發(fā)現(xiàn).由此可知，R2R3-MYB類蛋白在植物生長發(fā)育過程發(fā)揮作用，且不同物種中MYB-related類的蛋白在進(jìn)化過程中具有一定的差異性.

圖3 玉米與擬南芥R2R3-MYB類蛋白的進(jìn)化樹

圖4 玉米與擬南芥MYB-related類蛋白的進(jìn)化樹

2.4 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族抗旱蛋白成員的鑒定

在玉米中共鑒定出203個(gè)MYB成員，其中102個(gè)MYB成員有明確的結(jié)構(gòu)功能，101個(gè)MYB成員功能未知.根據(jù)功能篩選，玉米MYB成員中具有抗旱功能的蛋白有16個(gè)(如表2).16個(gè)MYB具有抗旱功能的蛋白質(zhì)長度介于225～563 aa；相對分子質(zhì)量大小25 246.7～61 659.3 kD；PI介于4.625 4～10.776 1.

表2 玉米MYB抗旱蛋白的性質(zhì)

2.5 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族抗旱蛋白的亞細(xì)胞定位分析

運(yùn)用ProtComp對玉米MYB抗旱蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示玉米MYB抗旱蛋白均集中定位于細(xì)胞核上.

2.6 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族抗旱蛋白保守基序分析

本研究在玉米MYB抗旱成員中共鑒定到10個(gè)保守基序，大部分玉米MYB抗旱成員都含有 Motif 1 和 Motif 9 (如圖5).R2R3-MYB類具有抗旱功能的蛋白所含保守基序種類最少.此外，本研究還發(fā)現(xiàn)一些特有的基序，如Motif 2、Motif 3、Motif 5、Motif 6、Motif 7、Motif 8和Motif 10為Zm3RMYB1-Zm3RMYB6所特有，且Motif的排列位置大概是相同的，并非隨機(jī)出現(xiàn)，而是具有一定的保守性.

2.7 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族抗旱蛋白結(jié)構(gòu)域分析

利用TBtools軟件分析了16個(gè)玉米MYB抗旱蛋白結(jié)構(gòu)域，由圖6可知，所有的玉米MYB蛋白均含有SANT結(jié)構(gòu)域，其中最復(fù)雜的結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在Zm2RMYB8 成員(含有2個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域和5個(gè)LCR區(qū)域)，屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中典型的R2R3-MYB型.最簡單的結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在 Zm2RMYB171成員(僅含有 SANT結(jié)構(gòu)域).其中，Zm3RMYB1-Zm3RMYB6的結(jié)構(gòu)域排布較為整齊，均含有3個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域，屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中典型的R3-MYB型.

圖5 玉米MYB抗旱蛋白的保守基序

圖6 玉米MYB抗旱蛋白結(jié)構(gòu)域

2.8 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族抗旱蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用SOPMA在線軟件預(yù)測玉米轉(zhuǎn)錄因子抗旱蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表3所示，玉米MYB抗旱蛋白結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲(Cc，random coil)和α螺旋(Hh，alpha helix)為主，并且同時(shí)包含部分的β折疊(Tt，beta turn)和延伸鏈(Ee，extended strand).三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果顯示(如圖7)，玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子抗旱蛋白結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)構(gòu)較為接近，符合預(yù)測結(jié)果.其無規(guī)則卷曲占比較大，此類結(jié)構(gòu)對蛋白功能的發(fā)揮有極其重要的作用.

表3 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子抗旱蛋白二級結(jié)構(gòu)特征預(yù)測

圖7 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子抗旱蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

續(xù)圖7

2.9 玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能預(yù)測及進(jìn)化樹分析

利用101個(gè)玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族未知功能蛋白的全長序列與已報(bào)道過具有明確功能的擬南芥MYB蛋白(如表4)共同構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(如圖8)，更好地定位到與抗旱有關(guān)的玉米MYB蛋白[11].進(jìn)化樹顯示，48個(gè)玉米MYB蛋白與擬南芥MYB具有抗旱功能的蛋白親緣關(guān)系較近，表明這48個(gè)MYB蛋白可能與玉米抵抗干旱脅迫功能有關(guān).

表4 擬南芥參與非生物脅迫的MYB轉(zhuǎn)錄因子

圖8 玉米MYB未知功能蛋白與擬南芥MYB類蛋白的進(jìn)化樹

植物時(shí)常處于限制其生長發(fā)育的環(huán)境條件下，干旱脅迫是嚴(yán)重影響植物生長的環(huán)境因素之一[12].由于玉米作為人類賴以生存的重要糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)受種植區(qū)域干旱脅迫的影響較為嚴(yán)重[13].MYB是真核生物中廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，其家族廣泛參與機(jī)體生長發(fā)育、生物脅迫應(yīng)答及非生物脅迫應(yīng)答等過程[14-17]，因此研究玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白應(yīng)答干旱脅迫具有十分重要的意義.

擬南芥中MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究較為透徹，AtMYB12、AtMYB75通過調(diào)節(jié)擬南芥中黃酮類物質(zhì)的含量來適應(yīng)干旱、高鹽的環(huán)境，AtMYB60通過調(diào)控氣孔關(guān)閉和根的生長來適應(yīng)干旱環(huán)境，AtMYB96通過整合ABA和生長素信號來增強(qiáng)抵抗干旱脅迫的能力，AtMYB15在低溫脅迫下，其表達(dá)量升高，AtMYB14通過調(diào)節(jié)CBFs的表達(dá)來參與抵抗低溫環(huán)境，AtMYB2、AtMYB73通過參與一系列調(diào)節(jié)途徑應(yīng)對高鹽脅迫環(huán)境，AtMYB4、AtMYB7、AtMYB32通過抑制苯丙烷各代謝分支途徑基因的表達(dá)來抵抗紫外線脅迫[11].有學(xué)者認(rèn)為可依據(jù)進(jìn)化樹中與擬南芥的親緣關(guān)系預(yù)測研究物種蛋白的功能[18].本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法，對從玉米中獲得203個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行了理化性質(zhì)、保守基序、蛋白結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)預(yù)測、功能預(yù)測、系統(tǒng)進(jìn)化等多方面分析，對其理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)等有了較全面的認(rèn)識[19-24].

3 結(jié)論

通過對玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子提交至Pfam在線軟件進(jìn)行分析，依據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域重復(fù)數(shù)量，將玉米MYB進(jìn)行分類，共分為MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB及5R-MYB五類.根據(jù)對玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子保守基序的分析，同一類家族成員具有相似的Motif且位置相同.根據(jù)PlantTFDB數(shù)據(jù)庫所得的101個(gè)無明確功能的玉米MYB類轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白與11個(gè)功能明確的擬南芥MYB類轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白作系統(tǒng)進(jìn)化樹，證明了相鄰或較近進(jìn)化關(guān)系上的48個(gè)玉米MYB蛋白可能具有相同或相似的功能.

綜上所述，本研究基于玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白數(shù)據(jù)，通過分析玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守基序、蛋白結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)預(yù)測和進(jìn)化關(guān)系，較為系統(tǒng)地鑒定了玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子家族.其中明確具有抗旱功能的蛋白有16個(gè)，未知功能的蛋白中有48個(gè)玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥中主要參與抗旱的MYB轉(zhuǎn)錄因子存在較近的親緣關(guān)系，推測可能與玉米抵抗干旱脅迫相關(guān).本研究為玉米抵抗干旱脅迫的功能提供了一定的理論基礎(chǔ)，具有重要意義.