溫紹海, 龐繼鑫, 杜廣祖, 陳 斌, 張立敏

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650201)

蠼螋屬于有翅亞綱Pterygota革翅目Dermaptera,也稱夾板蟲、剪刀蟲等[1]。自然感染蠼螋的昆蟲病原真菌種類較少,已報(bào)道有球孢白僵菌Beauveriabassiana感染歐洲球螋Forficulaauricularia和松球螋Forficulasp.[2],神農(nóng)架被毛孢Hirsutellashennongjiaensis感染未知種蠼螋[3],因而對蠼螋上球孢白僵菌菌株及其毒力的研究報(bào)道較為少見。

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(J. E. Smith)是一種嚴(yán)重為害玉米等糧食作物的跨境遷飛性害蟲,寄主植物范圍廣,繁殖力強(qiáng),遷飛擴(kuò)散快,為害程度重,防控難度大[4]。草地貪夜蛾自2019年1月入侵我國并迅速定殖、蔓延,嚴(yán)重威脅我國玉米生產(chǎn)安全[5]。昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾具有良好的致病作用,如萊氏綠僵菌Metarhiziumrileyi[6]、玫煙色擬青霉Paecilomycesfumosoroseus[7]、金龜子綠僵菌M.anisopliae和球孢白僵菌Beauveriabassiana[8-9]。然而,不同種類昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾的侵染致病作用不同,且在田間自然感染草地貪夜蛾的昆蟲病原真菌還不多見,僅鄭亞強(qiáng)等和雷妍圓等分別從云南和廣東玉米田發(fā)現(xiàn)并分離鑒定了感染草地貪夜蛾幼蟲的萊氏綠僵菌[10-11],程東美等在廣州玉米田發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾僵蟲并分離獲得了球孢白僵菌[12]。因此,開展昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾的毒力測定,篩選高致病力菌株十分必要。

本研究于2020年8月從云南省紅河州元陽縣大果公路和保山市隆陽區(qū)蒲縹鎮(zhèn)黃泥村玉米田采集到自然染病的蠼螋,根據(jù)蟲體形態(tài)特征和地理分布初步鑒定采集自元陽縣的蠼螋為寬翅球螋PterygidaeurypygaBey-Bienko,采集自隆陽區(qū)的蠼螋為華球螋ForficulasinicaBey-Bienko。通過形態(tài)與分子鑒定病原物為球孢白僵菌,并測定了其基本生物學(xué)特性和對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力,旨在為草地貪夜蛾生物防治提供菌種資源,同時(shí)也可為該兩株球孢白僵菌的生防潛力研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離培養(yǎng)

將采集到的蠼螋僵蟲,帶回室內(nèi)用無菌水保濕培養(yǎng),待產(chǎn)孢后挑取蟲體上的孢子,接于SDAY培養(yǎng)基[13],于溫度(25±1)℃,光周期L∥D=12 h∥12 h,相對濕度(75±5)%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后,將分生孢子轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。經(jīng)過反復(fù)純化,得到純的菌株,純化的菌株采用SDAY 斜面培養(yǎng)基保存于4℃冰箱備用。

1.2 菌株生物學(xué)特性

將保存的菌株作為備用菌株,以SDAY培養(yǎng)基作為供試培養(yǎng)基,設(shè)置22℃、25℃和28℃ 3種溫度條件(誤差±1℃),RH(75±5)%,光周期L∥D=12 h∥12h條件下的不同光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌落生長速率測定:采用菌液點(diǎn)接法[14-15]接種,配制1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液,用移液槍吸取5 μL滴于培養(yǎng)基正中間,等待菌液干后封好培養(yǎng)基,在恒溫光照培養(yǎng)箱(RG-300)中培養(yǎng);采用十字交叉法[16],定期用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(ARZ-1331)測量菌落直徑,并記錄其菌落形態(tài)和顏色等。產(chǎn)孢量測定:培養(yǎng)15 d后,用直徑為5 mm的打孔器,在培養(yǎng)基平板距離菌落中心位置到邊緣1/2處打孔截取菌塊,重復(fù)3次,分別放入含有10 mL 0.05%吐溫-80無菌水的無菌容器中,渦旋振蕩均勻,用微量移液器吸取適量孢子懸浮液滴在血球計(jì)數(shù)板上,如果顯微鏡視野下孢子數(shù)過多,以10倍進(jìn)行稀釋,至血球計(jì)數(shù)板上的孢子數(shù)可數(shù)為止,其中計(jì)算產(chǎn)孢量的公式中“80”代表血球計(jì)數(shù)板上80個(gè)正方形小格,靜置30 s后在顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)孢子數(shù)量,統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量[17]。孢子萌發(fā)率測定:將菌株孢子配制成1.0×107個(gè)/mL的懸浮液,吸取1 mL加入含有10 mL SDAY液體培養(yǎng)基的小錐形瓶中,在搖床中恒溫培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板觀察孢子萌發(fā)情況,以芽管長度>孢子半徑的孢子計(jì)為萌發(fā)孢子,觀察n次視野,觀察孢子總數(shù)>300個(gè)[18-19],計(jì)算萌發(fā)率。分生孢子大小及分生孢子梗測量:制作臨時(shí)玻片在顯微鏡下找到分散的分生孢子和分生孢子梗,用萊卡光學(xué)顯微鏡(Leica,750)電腦配套軟件LAS中的圖片處理-距離線測量孢子的大小和孢子梗的長度等。

1.3 菌株的分子鑒定

病原菌在SDAY培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后,取一皿長勢良好的菌刮取菌體,DNA提取使用CTAB法[20]略有改動(dòng),65℃恒溫水浴時(shí)間由1 h變?yōu)?0 min,將TE緩沖液換成ddH2O,其他步驟基本相同;采用真菌通用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;PCR反應(yīng)體系25 μL,ITS1F和ITS4各1 μL,PCR MasterMix 12.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL;PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,35個(gè)循環(huán);1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

依據(jù)測序得到的結(jié)果,將序列進(jìn)行編輯,去除兩端質(zhì)量不好的堿基,優(yōu)化好的序列提交到NCBI網(wǎng)站(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),選擇BLAST進(jìn)行比對,獲得與目標(biāo)菌株具有同源性的其他白僵菌菌株的堿基序列,從中下載同源性高的序列,使用MEGA 7.0軟件通過鄰接法(neighbor-joining method,NJ),運(yùn)行1 000次bootstrap驗(yàn)證,構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

1.5 菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力研究

用0.05% 吐溫-80無菌水沖洗培養(yǎng)基上的白僵菌分生孢子獲得孢子懸浮液,并在搖床(210 r/min)中振蕩30 min混勻,在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板配制1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105個(gè)/mL和1.0×104個(gè)/mL 5個(gè)濃度的孢子懸浮液,采用浸漬法[22]接種,用無菌鑷子挑選個(gè)體大小基本一致的草地貪夜蛾3齡幼蟲,浸入孢子懸浮液中5 s,然后挑出置于濾紙上吸干菌液,選擇活動(dòng)性強(qiáng)的個(gè)體轉(zhuǎn)移至已消毒的飼養(yǎng)盒,放入剪好的大小一致的新鮮玉米葉,每一處理20頭,重復(fù)3次,對照組(CK)用0.05% 吐溫-80無菌水處理。飼養(yǎng)盒為塑料格子盒(24格,單格尺寸4.2 cm×2.2 cm×3.5 cm),每蟲1格單頭飼養(yǎng),放入(25±1)℃,RH(75±5)%,光周期L∥D=12 h∥12 h的恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng),每隔24 h更換新鮮的玉米葉和清理糞便,并觀察供試草地貪夜蛾的行為及活動(dòng)情況、蟲體染菌情況,統(tǒng)計(jì)存活和死亡數(shù)量[23]。將死亡的蟲體,在滅菌培養(yǎng)皿中于(25±1)℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng),每天定時(shí)觀察死亡蟲體上菌體的生長和產(chǎn)孢情況,從而確定其為白僵菌感染致死。

1.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)如下公式分別計(jì)算不同處理幼蟲的死亡率、孢子萌發(fā)率和產(chǎn)孢量。毒力測定數(shù)據(jù)采用Probit方法分析,求出毒力回歸方程,計(jì)算LC50和LT50,分析與計(jì)算均用SPSS 25.0 數(shù)據(jù)處理軟件完成。

產(chǎn)孢量=孢子總數(shù)/80格×400×104×稀釋倍數(shù)/打孔器面積(個(gè)/cm2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離培養(yǎng)及形態(tài)鑒定

YY-1菌株在25℃、SDAY培養(yǎng)基上的生長特性,菌落最外有很小一圈是菌絲生長擴(kuò)散區(qū)域,白色絨毛狀;中間大部分是產(chǎn)孢區(qū)域,孢子白色,后期白色稍偏暗粉狀;菌落背面特征和正面相對應(yīng),正面凹陷的區(qū)域從背面看深入到培養(yǎng)基內(nèi)部也比較明顯,內(nèi)圈深褐色,外圈淡黃色或橘色;分生孢子近球形,大小(1.664～2.523)μm×(2.097～3.628)μm,分生孢子梗彎曲,產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)端部膨大,分生孢子梗長55～120 μm,直徑2.9～4.0 μm。

HNC-1菌株在25℃、SDAY培養(yǎng)基上,菌落正面顏色先為白色,后期變?yōu)榈S色,在產(chǎn)孢區(qū)域有淡黃色透明液滴滲出,正面形態(tài)大致分為兩個(gè)不同區(qū)域,最外圈是白色的菌絲生長擴(kuò)散區(qū),內(nèi)部區(qū)域是白色稍偏暗的產(chǎn)孢區(qū),孢子粉狀,后期變?yōu)殚偕?菌落背面大致分為二個(gè)區(qū)域,光滑無褶皺,外圈橘黃色,內(nèi)圈黃褐色;分生孢子橢圓形,大小(1.622～3.183)μm×(2.250～4.420)μm,產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)二分叉。分生孢子梗長80～160 μm,直徑2.3～3.7 μm。

2.2 菌株的分子鑒定

對菌株的測序結(jié)果進(jìn)行編輯,去除序列兩端質(zhì)量不好的堿基,將其在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對,YY-1菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的球孢白僵菌菌株Beauveriabassiana4510(KX901309.1)的親緣關(guān)系最近，相似性高達(dá)99.43%,HNC-1菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的球孢白僵菌菌株BeauveriabassianaBbTDK005(HQ222969.1)的相似性為99.81%,說明該菌株與數(shù)據(jù)庫中的球孢白僵菌菌株具有高度的相似性,綜合形態(tài)特征鑒定和ITS序列相似性分析,將該菌株確定為球孢白僵菌。

2.3 菌株的生物學(xué)特性

YY-1和HNC-1菌株在SDAY培養(yǎng)基上25℃的生長產(chǎn)孢情況,菌落生長速率分別為(3.06±0.20)mm/d和(4.57±0.23)mm/d;培養(yǎng)第15天時(shí)的產(chǎn)孢量分別為(5.20±1.06)×107個(gè)/cm2和(1.83±0.47)×108個(gè)/cm2,其孢子振蕩培養(yǎng)24 h后孢子的萌發(fā)率分別為(93.33±7.37)%和(87.67±6.43)%(表1);不同的溫度條件下YY-1菌株的生長速率(F=9.824,P<0.05)、產(chǎn)孢量(F=14.425,P<0.05)和孢子萌發(fā)率(F=4.123,P<0.05)差異顯著；HNC-1菌株的生長速率(F=27.422,P<0.05)、產(chǎn)孢量(F=28.728,P<0.05)和孢子萌發(fā)率(F=19.330,P<0.05)也有顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果表明,25℃是比較合適的生長產(chǎn)孢溫度,溫度過高或過低都不利于菌株的生長產(chǎn)孢。

圖1 蠼螋感染癥狀、白僵菌產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子的形態(tài)特征Fig.1 Field infection symptoms of earwig, sporulation structure and conidia of Beauveria bassiana

表1 球孢白僵菌YY-1和HNC-1在SDAY培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征1)Table 1 Culture characteristics of Beauveria bassiana YY-1 and HNC-1 on SDAY medium

圖2 基于ITS基因序列構(gòu)建YY-1和HNC-1菌株與其他球孢白僵菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ 法)Fig.2 Construction of phylogenetic tree of the YY-1 and HNC-1 strain and other related Beauveria bassiana strains based on ITS region sequence by neighbour-joining method

2.4 菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力

YY-1和HNC-1菌株在不同濃度孢子懸浮液下對草地貪夜蛾3齡幼蟲具有不同程度的致死作用,隨著孢子濃度的增加,致死作用逐漸增強(qiáng),接種孢子懸浮液后最早于第2天開始出現(xiàn)幼蟲死亡。在1.0×108個(gè)/mL濃度下,第8天草地貪夜蛾3齡幼蟲累計(jì)死亡率達(dá)83.3%和63.3%,在此試驗(yàn)條件下YY-1菌株的毒力效果好于HNC-1菌株(圖3)。

圖3 YY-1(a)和HNC-1(b)菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的累計(jì)死亡率Fig.3 Cumulative mortality of YY-1 (a) and HNC-1 (b) strains to the third instar larvae of Spodoptera frugiperda

球孢白僵菌YY-1和HNC-1菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50為1.56×105個(gè)/mL和2.11×105個(gè)/mL(表2)。YY-1和HNC-1菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死時(shí)間效應(yīng)隨其孢子懸浮液濃度的增加,草地貪夜蛾幼蟲的致死中時(shí)縮短,當(dāng)孢子懸浮液濃度從1×108個(gè)/mL降低到1×104個(gè)/mL,YY-1菌株的致死中時(shí)從4.23 d增加至20.23 d;HNC-1菌株的致死中時(shí)從6.12 d增加至22.14 d(表3)。可以看出在此試驗(yàn)條件下,YY-1菌株的效果好于HNC-1菌株。

表2 球孢白僵菌YY-1和HNC-1對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力Table 2 Toxicity of Beauveria bassiana YY-1 and HNC-1 to the third instar larvae of Spodoptera frugiperda

3 討論

本研究從玉米田間采集到2頭自然罹病的蠼螋成蟲,目前關(guān)于革翅目蠼螋的病原物報(bào)道較為少見,可能與革翅目身體構(gòu)造革質(zhì)堅(jiān)硬有關(guān),本研究根據(jù)外形特征初步鑒定采集自元陽的蠼螋為寬翅球螋,采集自隆陽區(qū)的蠼螋為華球螋,但鑒定結(jié)果可能存在誤差,因?yàn)椴糠稚眢w形態(tài)已被真菌感染難以辨別;從2頭蠼螋蟲體上分離到2株球孢白僵菌YY-1和HNC-1,在SDAY培養(yǎng)基上,25℃下兩株菌的生長產(chǎn)孢好于22℃和28℃,孢子萌發(fā)率無明顯差異,最適生長溫度與許多球孢白僵菌菌株相似[24-25]。

球孢白僵菌是一種常見的昆蟲病原真菌,作為一種常規(guī)生物殺蟲劑,具有高效、對非靶標(biāo)生物較安全等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的生物防治[26-27]。近年文獻(xiàn)報(bào)道了多株球孢白僵菌對草地貪夜蛾幼蟲的毒力,但是毒力效果差別較大,如分離于土壤的bbbj菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50為3.37×105個(gè)/mL,毒力比較高;而另一株bbhn菌株在108個(gè)/mL孢子濃度下處理7 d對草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死率低于50%[28]。分離自稻黑蝽Scotinopharalurida若蟲的GZSL-1菌株,在孢子濃度1×108個(gè)/mL時(shí)對草地貪夜蛾3齡幼蟲的累計(jì)校正死亡率可達(dá)100%[29];而ZJU435菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲接種10 d后的校正死亡率為23.3%,對4齡幼蟲幾乎無殺蟲活性[30];本試驗(yàn)從蠼螋上分離到的球孢白僵菌YY-1對草地貪夜蛾3齡幼蟲致病力較高,HNC-1菌株致病力一般。此外,本研究中HNC-1菌株雖然生長產(chǎn)孢較YY-1菌株好,但對草地貪夜蛾幼蟲的毒力效果卻低于YY-1菌株,因此還應(yīng)加強(qiáng)對YY-1菌株培養(yǎng)條件的研究,以期為該菌株開發(fā)提供依據(jù)。