吳彩云, 范琳娟, 徐雪亮, 劉子榮, 喻吉生, 康宏波,胡平華, 涂年生, 彭德良, 姚英娟*

(1. 江西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)應用微生物研究所, 南昌 330200; 2. 江西省吉安市農(nóng)業(yè)科學研究所, 吉安 343119; 3. 江西省吉安市泰和縣塘洲鎮(zhèn)綜合執(zhí)法隊, 吉安 343715; 4. 江西省吉安市永豐縣蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心, 吉安 331500; 5. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 北京 100193)

山藥為薯蕷科Dioscoreaceae薯蕷屬Dioscorea多年生草質藤本作物,是江西省重要的蔬菜作物,綜合種植效益遠高于其他經(jīng)濟作物,常年種植面積約1.3萬 hm2。江西省山藥品質優(yōu)異,在國內(nèi)外享有盛譽[1-2]。然而,長期以來由于受到土地資源和種植習慣等因素的影響,大多數(shù)山藥田常年連作栽培,土壤環(huán)境逐漸惡化,山藥線蟲病發(fā)生日益加重,山藥的產(chǎn)量和品質受到了極大影響,嚴重阻礙了江西省山藥的可持續(xù)發(fā)展[3-4]。姚英娟等[5]報道了江西省山藥線蟲病的田間發(fā)病率一般為30%～80%,嚴重的甚至達到100%,減產(chǎn)20%～50%,已成為制約江西省山藥產(chǎn)業(yè)的一大難題。目前,我國山藥的病原線蟲主要涉及2個屬6個種,分別是根結線蟲屬Meloidogyne的爪哇根結線蟲M.javanica[6]、南方根結線蟲M.incognita和花生根結線蟲M.arenaria[7],以及短體線蟲屬Pratylenchus的穿刺短體線蟲P.penetrans[8]、薯蕷短體線蟲P.dioscoreae[9]和咖啡短體線蟲P.coffeae[10-11]。南方根結線蟲和爪哇根結線蟲主要分布在河南、山東等山藥產(chǎn)地;穿刺短體線蟲主要分布在山東省;咖啡短體線蟲主要分布在江蘇、山東、安徽、河南等山藥產(chǎn)地[10]。然而,關于江西省山藥病原線蟲卻鮮有報道,僅有賀哲等[12]報道了瑞昌山藥短體線蟲病的病原為咖啡短體線蟲,江西省其他地區(qū)山藥線蟲病的病原種類和發(fā)生情況等均未見報道。

本研究于2019年-2020年對江西省山藥主要種植區(qū)的線蟲病進行采樣調(diào)查并對病原進行形態(tài)和分子鑒定,明確江西省山藥線蟲病主要病原線蟲種類及地理分布,為進一步研究山藥線蟲病的發(fā)生規(guī)律及科學防治奠定理論基礎,為江西省山藥產(chǎn)業(yè)線蟲病綜合防控和可持續(xù)發(fā)展提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品:2019年1月至2020年12月,在各山藥種植地采用五點取樣法隨機采集江西省7市27縣(市)的共計157份山藥塊莖樣品,標記后帶回實驗室進行線蟲分離。

主要試劑及儀器:10×PCR Buffer(Mg2+free)、蛋白酶K、PremixTaqTM、DNA凝膠回收試劑盒,日本TaKaRa公司;pEASY-T1 Cloning Kit,北京全式金公司。Bio-rad T100 PCR擴增儀(Bio-rad),SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博訊);光學顯微鏡(Nikon);DYCP-31DN電泳儀(北京六一);Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)。

1.2 線蟲分離與形態(tài)學觀察

采用貝爾曼漏斗法分離線蟲。將單層廚房用紙均勻鋪于漏斗中,切取山藥塊莖約250 g置漏斗中,加入200 mL無菌水,25℃靜置24 h后,接取線蟲液約10 mL鏡檢。從線蟲液中挑取單條病原線蟲,60℃殺死分離到的線蟲后,在顯微鏡下觀察線蟲的形態(tài)特征,依據(jù)劉維志[13]的《植物線蟲志》和謝輝[14]的《植物線蟲分類學》進行屬的鑒定,分別統(tǒng)計各屬線蟲的數(shù)量。山藥塊莖樣品的采集地點和地理信息見表1。

表1 江西省山藥線蟲樣品的采集信息和形態(tài)學鑒定結果Table 1 Geographic information and genus identification of nematode populations collected from yam fields in Jiangxi province

續(xù)表1 Table 1(Continued)

1.3 線蟲的分子鑒定

單條線蟲的DNA提取方法參見王江嶺等[15]。以單條線蟲DNA為模板,采用引物對TW81(5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′)和AB28(5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′)擴增rDNA-ITS區(qū)片段,退火溫度為55℃[16]。采用引物對D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3B(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′) 擴增rDNA 28S D2-D3區(qū)片段,退火溫度為55℃[17]。對于根結線蟲屬種類的分子鑒定,同時采用引物對NAD5F2(5′-TATTTTTTGTTTGAGATATATTAG-3′)和NAD5R1(5′-CGTGAATCTTGATTTT-

CCATTTTT-3′)擴增mtDNA的Nad5基因片段,退火溫度為45℃[18]。PCR反應體系:DNA模板為3 μL,10 μmol/L的上、下游引物各1 μL,2×PremixTaqTM12.5 μL,滅菌ddH2O補足至25 μL。擴增條件為:94℃預變性4 min;94℃變性30 s,55℃/45℃退火30 s,72℃延伸1 min(根據(jù)擴增產(chǎn)物大小確定),32個循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用DNA凝膠回收試劑盒進行純化,用pEASY-T1 Cloning Kit克隆后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。采用DNAstar軟件進行序列拼接,對所測序列進行同源性分析,并提交GenBank獲得序列號。

1.4 系統(tǒng)進化樹的構建和地理分布分析

從GenBank下載相關線蟲種類的rDNA-ITS和rDNA 28S D2-D3同源序列并進行序列的相似性分析。采用MEGAX軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,以大豆孢囊線蟲Heteroderaglycines作為外群。通過統(tǒng)計分析明確江西省各地區(qū)采集山藥樣品的線蟲種類發(fā)生情況。

2 結果與分析

2.1 江西省山藥線蟲種類的形態(tài)鑒定結果

從江西省7市27縣(市)共采集山藥塊莖樣品157份,分別采自‘永豐淮山’‘竹篙薯’‘瑞昌山藥’‘腳板薯’等山藥品種,其中62份有線蟲侵染,不同的山藥種類均有不同程度的受害情況。山藥塊莖上分離到的線蟲經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn),病原線蟲為短體線蟲屬Pratylenchus和根結線蟲屬Meloidogyne線蟲。短體線蟲侵染的塊莖表面有近圓形或不規(guī)則稍凹陷的褐色病斑,感病嚴重的塊莖病斑上有很多龜裂狀的縱向裂紋。切開病莖,縱切面有深褐色或黃褐色的黏腐糊狀病組織,嚴重時,塊莖腐爛并散發(fā)腐臭氣味。根結線蟲侵染的塊莖表面呈暗褐色,多數(shù)塊莖畸形。在線蟲侵入點附近腫脹,凸起,形成許多大小不一的根結,發(fā)病嚴重的塊莖產(chǎn)生疙瘩,表皮腐爛。

2.2 分子鑒定結果

為進一步確定線蟲的種類,從物種水平準確區(qū)分開,本研究對表1中發(fā)病率高的地區(qū)中共11份線蟲樣品進行了分子鑒定。種群編號為THTZCT-2、THTZH-2、YFZXF-1、THTZQS-1、THKZCWJ-2、YFMT-2、YFSCJ-2、YFXWJ-2、THTZZJ的病原線蟲ITS序列擴增產(chǎn)物大小為1 035～1 041 bp,rDNA 28S D2-D3區(qū)序列擴增產(chǎn)物大小為759～782 bp。序列經(jīng)克隆測序后,于NCBI中BLAST同源性檢索為咖啡短體線蟲P.coffea,GenBank登錄號詳見表2。編號為JJMHL-2的病原線蟲ITS序列擴增產(chǎn)物為558 bp,rDNA 28S D2-D3區(qū)序列擴增產(chǎn)物大小為759 bp,BLAST同源性檢索為南方根結線蟲M.incognita。編號為RCFZ-1的病原線蟲ITS序列擴增產(chǎn)物為557 bp,BLAST檢索發(fā)現(xiàn)與埃塞俄比亞根結線蟲M.ethiopic(KY882495)的序列相似性最高,為92.13%。rDNA 28S D2-D3區(qū)序列擴增產(chǎn)物大小為760 bp,BLAST檢索與南方根結線蟲M.incognita多個序列相似性高達99.21%。為了進一步確定該線蟲種類,對該線蟲的Nad5基因擴增并測序,BLAST檢索為南方根結線蟲。部分山藥樣品中病原線蟲PCR檢測結果見圖1。

圖1 山藥樣品中病原線蟲PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR product from genes of pathogenic nematode in yam samples

表2 山藥樣品中線蟲分子鑒定結果Table 2 Molecular identification results of nematodes in yam samples

2.3 病原線蟲種群系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將測定的序列與不同地區(qū)的短體線蟲和根結線蟲種群的序列進行比對后構建系統(tǒng)進化樹(圖2),選擇大豆孢囊線蟲H.glycines作為外群?；贗TS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示,山藥樣品中分離的短體線蟲屬線蟲(種群編號為THTZCT-2、THTZH-2、YFZXF-1、THTZQS-1、THKZCWJ-2、YFMT-2、YFSCJ-2、YFXWJ-2、THTZZJ)與咖啡短體線蟲聚為1個分支,樣品中分離的根結線蟲屬線蟲(種群編號為RCFZ-1和JJMHL-2)與南方根結線蟲聚為1個分支。此外,基于rDNA 28S D2-D3序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹也得到一致的結果。

圖2 基于rDNA-ITS序列和rDNA 28S D2-D3區(qū)序列的病原線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of pathogenic nematodes based on rDNA-ITS sequences and rDNA 28S D2-D3 sequences

2.4 江西省山藥線蟲的種類和地理分布

對江西省157份山藥塊莖樣品的線蟲發(fā)生情況進行統(tǒng)計分析,吉安市、九江市、宜春市、贛州市和撫州市山藥主產(chǎn)區(qū)均存在線蟲危害情況,萍鄉(xiāng)市和南昌市山藥樣品中未檢測到病原線蟲(表3)。在62份線蟲侵染樣品中,短體線蟲屬侵染樣品有45份(含根結線蟲屬與短體線蟲屬復合侵染的山藥樣品8份),占總山藥線蟲侵染樣品數(shù)的72.6%;根結線蟲屬侵染樣品有27份(含兩類線蟲復合侵染的山藥樣品8份),占總山藥線蟲樣品數(shù)的43.5%。在吉安市62份山藥樣品中,短體線蟲屬單一侵染樣品有27份,根結線蟲屬單一侵染樣品有7份,短體線蟲屬線蟲和根結線蟲屬線蟲復合侵染的山藥樣品有3份,咖啡短體線蟲為優(yōu)勢種群。對吉安市的山藥樣品進一步分析,發(fā)現(xiàn)永豐縣和泰和縣的線蟲發(fā)病率較高,其中永豐縣的山藥線蟲侵染率為66.7%,泰和縣的山藥線蟲侵染率高達88.9%,而在遂川縣、吉水縣、吉安縣、萬安縣的山藥樣品中均未發(fā)現(xiàn)病原線蟲。

表3 江西省采集山藥樣品線蟲侵染的發(fā)生情況Table 3 The occurrence of nematode infection in yam collected in Jiangxi province

咖啡短體線蟲是江西省山藥主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢種群,在吉安市、九江市、撫州市和贛州市等地均廣泛分布,其中吉安市永豐縣和泰和縣兩地危害最為嚴重。南方根結線蟲雖不是優(yōu)勢種群,但在江西省大部分地區(qū)都有零星發(fā)生。此外,樣品中也存在單一種群侵染和復合種群侵染的情況。

3 討論

線蟲病的危害是目前山藥種植中的一個重要問題,嚴重制約山藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而要實現(xiàn)對山藥線蟲病的治理,首先必須對其線蟲種類進行鑒定,明確其在山藥主產(chǎn)區(qū)的分布,才能有的放矢制定治理策略。

利用形態(tài)學特征及分子生物學鑒定相結合的方法對病原線蟲種類鑒定是國內(nèi)外研究者常采用的研究方法,其準確性和可靠性較高[19-20]。本文對江西省各地的山藥種植區(qū)進行取樣,共取得山藥塊莖樣品157份,分別采自‘永豐淮山’‘竹篙薯’‘瑞昌山藥’‘腳板薯’等山藥品種。通過病原線蟲分離,形態(tài)學觀察共獲得62份病原線蟲侵染的樣品,且不同的山藥種類均有不同程度的受害情況。通過分子生物學技術對病原線蟲進行種類鑒定,明確了病原線蟲種類為咖啡短體線蟲和南方根結線蟲。將咖啡短體線蟲的rDNA-ITS序列和28S序列進行同源性分析,發(fā)現(xiàn)同源性結果與采樣地理來源之間沒有明顯關系。其中采自吉安市泰和縣塘洲鎮(zhèn)的短體線蟲(編號為THTZQS-1),其rDNA-ITS序列和28S序列突變/插入率均比其他地區(qū)的線蟲要高,采用高保真酶得到的序列也是如此。此現(xiàn)象產(chǎn)生原因是否與田間環(huán)境有關,需要進一步研究。

本研究通過對江西省山藥主產(chǎn)區(qū)7市27縣的山藥進行取樣,明確了病原線蟲為咖啡短體線蟲和南方根結線蟲,咖啡短體線蟲在江西大多地區(qū)都有廣泛分布,為江西省山藥主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢種群。南方根結線蟲主要在九江、宜春等地分布較多。值得注意的是,江西山藥主產(chǎn)區(qū)中,以吉安市永豐縣和泰和縣兩地的山藥線蟲危害最為嚴重,山藥線蟲侵染率分別為66.7%和88.9%,且線蟲種類多為咖啡短體線蟲。這可能與當?shù)胤N植品種單一、種植年限長、種植習慣和山藥的常年連作等有關。有研究表明,農(nóng)戶的一些錯誤種植習慣,如施肥不當,會引發(fā)土壤鹽漬化和理化性狀改變;連作導致土壤養(yǎng)分分布不均衡,土壤線蟲和有害微生物增多且頑固,土壤微生物間的拮抗作用削弱,均會加重土傳線蟲病的發(fā)生[21-23]。

綜上所述,本研究表明江西省山藥病原線蟲主要為咖啡短體線蟲和南方根結線蟲。咖啡短體線蟲在江西省大部分地區(qū)都有廣泛分布,是江西省山藥主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢種群,且以吉安市永豐縣和泰和縣兩地的線蟲危害最為嚴重。南方根結線蟲明顯較咖啡短體線蟲少,雖不是優(yōu)勢種群,但是分布也比較廣泛。本研究基本明確了江西省山藥種植區(qū)引起線蟲病的線蟲種類和地理分布情況,為山藥線蟲病的防治提供了理論指導。