智 慧, 周如軍, 郝 寧, 李自博, 陳計(jì)澎, 樸靜子

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué), 沈陽 110866)

白鮮DictamnusdasycarpusTurcz.為蕓香科白鮮屬多年生草本藥用植物[1],廣泛分布于中國、日本和韓國,我國東北、華北、西北及華東等地區(qū)均有豐富的野生資源[2-3]。白鮮以根皮入藥,富含白鮮堿(dictamnine)、梣酮(fraxinellone)、黃柏酮(obacunone)等多種活性成分,在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中用于治療濕疹、風(fēng)濕熱痹和疥癬瘡毒等癥[4-5]?，F(xiàn)代藥物學(xué)研究表明,其揮發(fā)油、醇提物和水提物中生物活性成分還具有抗癌、消炎和殺蟲[6-7]等功效,有極高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著白鮮野生資源枯竭、經(jīng)濟(jì)效益逐漸提高及市場需求量的日益增加,近年來,遼寧撫順和本溪等地開始大面積人工栽培。栽培區(qū)域和種植面積的逐漸擴(kuò)大使其病害問題日漸突顯,現(xiàn)已成為制約白鮮種植業(yè)發(fā)展的主要瓶頸問題之一。

白鮮與五味子、細(xì)辛等遼寧傳統(tǒng)道地藥用植物相比人工栽培歷史較短,研究基礎(chǔ)相對(duì)薄弱,國內(nèi)外文獻(xiàn)僅見灰斑病、莖點(diǎn)霉葉斑病和立枯病記載。莖點(diǎn)霉葉斑病在韓國和中國吉林白鮮種植區(qū)發(fā)生普遍,發(fā)病率可達(dá)100%,病原為Phomadictamnicola[3,8,17]。吉林白鮮生產(chǎn)中還發(fā)現(xiàn)由Rhizoctoniasp.引致的苗期立枯病[9]危害。作者研究團(tuán)隊(duì)前期調(diào)查發(fā)現(xiàn),白鮮灰斑病為遼寧新發(fā)生病害,遼寧撫順地區(qū)發(fā)生普遍,危害嚴(yán)重,病田率100%,病株率42%～78%[12],鑒定病原為Paracercosporadictamnicola[10],并進(jìn)一步開展了生物學(xué)特性研究[11]。近年來,遼寧白鮮種植區(qū)域和種植面積逐漸擴(kuò)大,為了進(jìn)一步明確生產(chǎn)中病害種類及危害情況,本文系統(tǒng)開展了病害調(diào)查和病原鑒定工作,旨在為白鮮病害的田間識(shí)別診斷和病害防控策略制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查

2018年-2020年生長季,對(duì)遼寧本溪、清原和西豐等白鮮主要種植區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查,對(duì)每個(gè)種植區(qū)的白鮮田塊進(jìn)行隨機(jī)調(diào)查,調(diào)查田塊數(shù)量不少于3塊,采用五點(diǎn)取樣法,每點(diǎn)隨機(jī)調(diào)查100株,記錄病害癥狀和危害程度,分別計(jì)算病害的病葉率、病株率和病情指數(shù)[13],并對(duì)危害部位和典型癥狀進(jìn)行拍照。白鮮灰斑病和莖點(diǎn)霉葉斑病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 白鮮灰斑病及莖點(diǎn)霉葉斑病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of gray leaf spot and leaf spot of Dictamnus dasycarpus

病株率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%;

病葉率=發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)×100%;

1.2 形態(tài)鑒定

白鮮灰斑病、莖點(diǎn)霉葉斑病和根腐病采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原真菌分離[15],取具有典型癥狀的白鮮病葉和病根,在病健交界處切取5 mm×5 mm小塊病組織,75%乙醇浸泡5～10 s,經(jīng)20%次氯酸鈉表面消毒3～5 min,無菌水洗3次,將病組織置于PDA平板上,25℃恒溫培養(yǎng),逐日觀察,挑取菌落邊緣菌絲于PDA上純化后置于4℃冰箱保存。對(duì)于白鮮立枯病,將染病莖基部切成小塊病組織,用無菌水清洗后放入WA平板上, 25℃恒溫培養(yǎng),菌落長出后挑取邊緣菌絲于PDA平板進(jìn)行純化培養(yǎng)。參照謝輝[16]的方法,對(duì)根結(jié)線蟲2齡幼蟲和4齡幼蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征觀察。以上病原結(jié)合形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)性狀參照相關(guān)文獻(xiàn)鑒定病原種類[17]。

1.3 分子鑒定

1.3.1DNA提取

將4種供試白鮮真菌病害的菌絲塊置于鋪有無菌玻璃紙的PDA上,25℃恒溫光照條件下培養(yǎng)7 d后收集菌絲。取烘干的菌絲,液氮研磨,采用改良的CTAB法提取菌絲DNA[18]。線蟲DNA的提取參照彭德良等[19]的方法。

1.3.2PCR反應(yīng)條件

供試病原真菌分子鑒定ITS引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[20]。LSU引物為NL1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)[21]。根結(jié)線蟲ITS引物M18S(5′-AACCTGCTGCTGGATCATTAC-3′)和M28S(5′-GTATGCTTAAGTTCAGCG-3′)[22]。 PCR體系:Mix 9.5 μL,上下游引物各 1.0 μL,DNA 1.0 μL和ddH2O 12.5 μL, 共25 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,條帶清晰的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,獲得基因片段序列。

1.4 致病性測定

白鮮灰斑病和莖點(diǎn)酶葉斑病致病性測定均選取長勢一致的健康葉片,使用10 μL 1.0×106個(gè)/mL孢子懸浮液噴霧接種,25℃保濕培養(yǎng),以無菌水為對(duì)照組,每試驗(yàn)重復(fù)3次,逐日觀察發(fā)病情況。

白鮮根腐病和立枯病致病性測定則選取長勢一致的1年生植株,將10 μL 1.0×106個(gè)/mL孢子懸浮液灌入根莖部,無菌水為對(duì)照組,25℃保濕培養(yǎng),每試驗(yàn)重復(fù)3次,逐日觀察發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 白鮮病害種類及危害情況

2018年-2020年對(duì)遼寧本溪、清原和西豐等7個(gè)白鮮種植區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查,結(jié)果顯示(表2),近年來遼寧省白鮮主要病害有5種,分別為灰斑病、莖點(diǎn)霉葉斑病、立枯病、根腐病和根結(jié)線蟲病。其中,灰斑病、莖點(diǎn)霉葉斑病和立枯病分布較廣。本溪地區(qū)白鮮灰斑病和莖點(diǎn)霉葉斑病的發(fā)生最為嚴(yán)重,且發(fā)病率呈遞增趨勢,2018年病株率分別高達(dá)100%和93.3%,病情指數(shù)分別為29.6和19.2,2019年病株率分別為100%和99%,病情指數(shù)分別達(dá)29.9和19.6。寬甸地區(qū)白鮮立枯病發(fā)生最為嚴(yán)重,病田率高達(dá)19.0%。白鮮根腐病和根結(jié)線蟲病發(fā)生較輕,其中根結(jié)線蟲病僅在本溪地區(qū)發(fā)生。

白鮮葉部病害分布廣、危害重,其中灰斑病在7個(gè)地區(qū)均有分布,且本溪、西豐、清原、新賓、沈陽和寬甸地區(qū)的病株率均為100%,莖點(diǎn)霉葉斑病在4個(gè)地區(qū)均有分布,其中本溪地區(qū)危害最重,2018年病株率高達(dá)93.3%。白鮮根及莖部病害也均有發(fā)生,立枯病在7個(gè)地區(qū)均有分布,病株率高達(dá)19%,而根腐病零星發(fā)生。

調(diào)查中發(fā)現(xiàn),白鮮病害地區(qū)間分布顯著不均衡,其中本溪和清原地區(qū)病害種類最為豐富,5種病害在本溪地區(qū)均有分布,而新賓和寬甸等地區(qū)為新發(fā)展區(qū)域,白鮮種植年限短,病害種類和嚴(yán)重度相對(duì)較輕。

2.2 白鮮葉部病害癥狀及病原

2.2.1灰斑病

白鮮灰斑病主要危害葉片,發(fā)病初期葉片產(chǎn)生黃褐色小斑點(diǎn),病斑逐漸擴(kuò)展,呈橢圓形或多角形灰褐色病斑,有黃色暈圈,病斑上具深褐色針尖大小粒狀物。發(fā)病嚴(yán)重時(shí),病斑互相愈合成不規(guī)則病斑,明顯受葉脈限制形成多角形,后期導(dǎo)致黃化提早落葉(圖1a～b)。

病菌在PDA培養(yǎng)基上生長緩慢,氣生菌絲不發(fā)達(dá),培養(yǎng)基內(nèi)菌絲顏色較深,中心稍突起(圖1c)。子座直徑50～125 μm,分生孢子梗淺棕色,直立或彎曲,(25.0～75.0)μm×(2.5～5.8)μm, 0～4隔。分生孢子近無色或淡青黃褐色,倒棍棒至圓柱形,少直立,多彎曲至明顯彎曲,個(gè)別成S形,大小(82.5～227.5)μm×(3.8～6.3)μm,5～16隔(圖1d～e)。結(jié)合病原形態(tài)、培養(yǎng)性狀、分子測序和致病性測定,并參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]鑒定病原為白鮮擬尾孢Paracercosporadictamnicola。

圖1 白鮮灰斑病田間癥狀和病原形態(tài)Fig.1 Symptom and pathogen characteristics of gray spot disease on Dictamnus dasycarpus

2.2.2莖點(diǎn)霉葉斑病

白鮮莖點(diǎn)霉葉斑病主要危害葉片,發(fā)病初期,出現(xiàn)邊緣深褐色中間褐色小斑點(diǎn),隨后病斑擴(kuò)展呈圓形或橢圓形,中央灰白色、邊緣褐色,病斑邊緣出現(xiàn)明顯黃色暈圈。病斑易出現(xiàn)大量小黑點(diǎn),即分生孢子器。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致整株葉片變黃,葉片邊緣卷曲枯萎,直至脫落(圖2a～b)。

病原菌在PDA培養(yǎng)基上呈圓形或近圓形,菌絲初期呈白色絨毛狀,后期呈深褐色,培養(yǎng)10～15 d后,可見大量黑色分生孢子器,呈輪紋狀分布。分生孢子橢圓形、腎形,單孢,無色,兩端各含1個(gè)油球,大小為(4～9.5)μm×(1.3～4.2)μm(圖2c～d),結(jié)合病原形態(tài)、培養(yǎng)性狀、分子測序和致病性測定,并參考相關(guān)文獻(xiàn)[3,23]，鑒定為白鮮莖點(diǎn)霉Phomadictamnicola。

圖2 白鮮莖點(diǎn)霉葉斑病癥狀和病原形態(tài)Fig.2 Symptom and pathogen characteristics of leaf spot disease on Dictamnus dasycarpus

2.3 白鮮根部病害癥狀及病原

2.3.1根腐病

白鮮根腐病主要危害2～5年生植株。主要侵染根部,發(fā)病初期地上部分出現(xiàn)黃化、枯萎,土壤濕度大時(shí)根莖交界處可見白色棉絮狀菌絲體,莖基部或地下根腐爛、根皮易脫落,呈朽腐狀,嚴(yán)重發(fā)生導(dǎo)致整株枯死(圖3a～b)。

圖3 白鮮根腐病癥狀和病原形態(tài)Fig.3 Symptom and pathogen characteristics of root rot disease on Dictamnus dasycarpus

病菌在PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲發(fā)達(dá),菌絲白色質(zhì)密,生長速率為0.88 cm/d。分生孢子分為小型分生孢子和大型分生孢子,小型分生孢子單孢,卵形,大小為(5.4～7.9)μm×(2.1～3.8)μm;大型分生孢子鐮刀形,兩端細(xì)胞稍尖,少許彎曲,有2～3個(gè)隔膜,大小為(17.7～26.1)μm×(3.0～4.3)μm(圖3c～d)。結(jié)合病原形態(tài)、培養(yǎng)性狀、分子測序(Accession No.MT154248)和致病性測定,鑒定病原為尖鐮孢Fusariumoxysporum。

2.3.2立枯病

白鮮立枯病主要在一年生幼苗期發(fā)生,主要危害白鮮莖基部,發(fā)病初期可觀察到個(gè)別幼苗發(fā)病,病株葉片枯黃萎蔫,莖基部逐漸縊縮,嚴(yán)重時(shí),病斑深入莖內(nèi),環(huán)繞整個(gè)莖基部,致使幼苗枯萎死亡,最終倒伏。田間發(fā)病中心明顯,并迅速向四周蔓延,幼苗成片死亡,常造成缺苗斷垅現(xiàn)象(圖4a～b)。

圖4 白鮮立枯病癥狀和病原形態(tài)Fig.4 Symptom and pathogen characteristics of damping-off disease on Dictamnus dasycarpus

病菌在PDA培養(yǎng)基上初期為灰白色或淡黃色,后變黃色或黃褐色。菌絲初期無色,纖細(xì),后期粗壯,黃褐色至深褐色,隔膜明顯,分支基部稍縊縮,與主菌絲成直角,直徑為3.3～8.2 μm(圖4c)。結(jié)合病原形態(tài)、培養(yǎng)性狀、分子測序和致病性測定,鑒定病原為立枯絲核菌Rhizoctoniasolani。

2.3.3根結(jié)線蟲病

主要危害白鮮根部,尤其在須根上生成大量大小不等的根結(jié),田間發(fā)生中心明顯,傳播速度快。發(fā)病初期地上部癥狀不易診斷,但隨著根系受害加重,地上部植株出現(xiàn)葉片無光澤、易萎蔫黃化、葉緣卷曲。發(fā)病植株較健康植株生長明顯受到抑制,葉片少且小,植株矮化,根短小,后期地上部分枯萎死亡(圖5a～b)。

圖5 白鮮根結(jié)線蟲病癥狀和病原Fig.5 Symptom and pathogen characteristics of Meloidogyne hapla on Dictamnus dasycarpus

雌蟲白色,體梨形或球形,頸短,頭區(qū)大,無環(huán)紋,口針纖細(xì),基球圓形和桿部有明顯界線,錐部向背部稍稍彎曲,桿部末端最寬,會(huì)陰花紋圓形或略帶方形。背弓扁平,線紋平滑到波浪形,尾端區(qū)通常有刻點(diǎn)(圖5A～D)。雄蟲頭不突出,頭端平截到半球形,頭區(qū)通常和身體有明顯的界線,并寬于第一體環(huán),口針細(xì)長,基部球圓形,側(cè)區(qū)4條側(cè)線,尾部鈍圓,交合刺彎曲,具一尖突,引帶半月形,兩端稍細(xì)長。2齡幼蟲蠕蟲狀、后端細(xì),頭不突出,頭區(qū)不縊縮,平截錐形,口針基球圓形,唇后無環(huán)紋,側(cè)區(qū)4條側(cè)線,具不規(guī)則橫紋,半月體緊靠排泄孔前,尾末端漸細(xì),有3～5縊痕,末端鈍錐形,尾部有明顯透明區(qū)(圖5E～F)。結(jié)合形態(tài)測定和分子測序(Accession No. ITS:MK610794; 18S: MK610792),鑒定病原為北方根結(jié)線蟲Meloidogynehapla[24]。

3 討論

近年來中藥材種植已成為農(nóng)業(yè)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革和脫貧攻堅(jiān)的主要產(chǎn)業(yè)之一。白鮮是遼寧道地藥用植物,由于野生資源逐漸枯竭,近年來開始人工歸圃,隨著市場需求的增大,經(jīng)濟(jì)效益的提高,栽培面積逐年增加,同時(shí)病蟲害發(fā)生危害也明顯加重。本文對(duì)本溪、清原和西豐等7個(gè)白鮮種植區(qū)開展了系統(tǒng)的調(diào)查工作,發(fā)現(xiàn)白鮮病害種類較多,新病害頻發(fā)。目前,生產(chǎn)上主要病害有5種,分別為由Phomadictamnicola引起的莖點(diǎn)霉葉斑病、Paracercosporadictamnicola引起的灰斑病、R.solani引起的立枯病、F.oxysporum引起的根腐病和M.hapla引起的根結(jié)線蟲病。其中,莖點(diǎn)霉葉斑病和灰斑病分布廣且危害重,病株率分別為17.6%～99.0%和38.2%～100.0%。

藥用植物生產(chǎn)研究是中藥研究與開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),健康優(yōu)質(zhì)種苗是中藥材生產(chǎn)的基礎(chǔ)。調(diào)查中發(fā)現(xiàn),白鮮苗期病害發(fā)生相對(duì)嚴(yán)重,主要為立枯病和根結(jié)線蟲病。其中,立枯病發(fā)生最為普遍,調(diào)查地區(qū)育苗田均有發(fā)生,病株率為0.6%～19.0%。根結(jié)線蟲病主要在本溪地區(qū)發(fā)生,2018年病田率為20%,病株率平均9.1%,病害傳播擴(kuò)散速度極快,且難以根治。由于中藥材生產(chǎn)面對(duì)市場經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)組織體系尚未完善,地區(qū)間種苗調(diào)運(yùn)尤為頻繁,種苗及根基土壤可以攜帶大量的病原生物,造成遠(yuǎn)距離傳播危害[25-26]。白鮮作為遼寧一種新興的中藥材種類,正處于蓬勃發(fā)展期,立枯病和根結(jié)線蟲病是中藥材生產(chǎn)中重要的土傳病害,可以隨種苗調(diào)運(yùn)、土壤和苗期噴灌進(jìn)行遠(yuǎn)距離和近距離傳播,存在較大的傳播風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)密切關(guān)注和重點(diǎn)防范。

名貴藥用植物常為多年生,隨著種植年限的增加,病害發(fā)生逐漸加重,其主要原因?yàn)椴≡锏闹鹉攴e累。白鮮通常人工種植3～5年[27],栽培周期較長。調(diào)查發(fā)現(xiàn),遼寧本溪和清原地區(qū)白鮮種植相對(duì)較早,經(jīng)過多年種植,該地區(qū)白鮮生產(chǎn)中病害種類最為豐富,且新病害頻發(fā),危害嚴(yán)重,除本文鑒定的5種病害外,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)多種生理性病害及柑橘鳳蝶PapilioxuthusLinnaeus、金鳳蝶P.machaonLinnaeus和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)等害蟲取食為害,而新賓、遼中和西豐等新種植區(qū),多為1～3年生植株,病害種類相對(duì)較少,且危害輕,但隨著種植年限的增加,病蟲害防控亦不容忽視。由于白鮮病蟲害研究相對(duì)薄弱,發(fā)生條件、侵染特性和流行動(dòng)態(tài)尚未明確,缺乏規(guī)范化防控技術(shù),難以滿足生產(chǎn)中病蟲害防控需求,應(yīng)盡快開展發(fā)生條件、流行動(dòng)態(tài)、致病機(jī)制及防治技術(shù)等相關(guān)研究工作,以保障遼寧白鮮產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。