代惠潔, 燕 穎, 趙 靜, 喬 寧, 張德珍, 竺曉平, 孫小桉

(1. 濰坊科技學(xué)院,山東省設(shè)施園藝生物工程研究中心, 壽光 262700; 2. 濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院, 山東省生物化學(xué)與分子生物學(xué)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 濰坊 261061; 3. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 山東省蔬菜病蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 泰安 271018)

煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒tomato chlorosis virus(ToCV)是一種嚴(yán)重危害我國(guó)番茄生產(chǎn)的重要新生病毒[1]。該病毒屬長(zhǎng)線形病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinivirus,于1998年在美國(guó)佛羅里達(dá)州番茄種植區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)[2],隨后迅速在全球范圍內(nèi)暴發(fā)、流行。魏可可等[3]根據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),除南極洲和大洋洲之外,其余5大洲20多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有ToCV的報(bào)道。我國(guó)于2004年首次在臺(tái)灣檢測(cè)到ToCV的發(fā)生[4],隨后在北京[5]、山東[6-7]、河南[8]、天津[9]、山西[10]、江蘇[11]、遼寧[12]、廣東[13]、湖南[14]等全國(guó)各地大范圍發(fā)生、流行,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

ToCV寄主范圍廣,可侵染茄科Solanaceae、菊科Asteraceae、十字花科Brassicaceae等25科85種植物,主要以番茄、茄子等茄科植物為主,尤其對(duì)番茄的危害嚴(yán)重[15-17]。發(fā)病初期葉片脈間黃化,部分區(qū)域變紅,發(fā)育受阻,輕微卷曲,一般下部老葉先發(fā)病,新生枝條和葉片表現(xiàn)正常;隨著病害發(fā)展,發(fā)生脈間壞死,葉片變厚變脆且易碎、最后干枯脫落;成熟期由于光合作用減弱導(dǎo)致坐果數(shù)量減少、果實(shí)變小、轉(zhuǎn)色時(shí)間延長(zhǎng),極大降低了品質(zhì)與產(chǎn)量[18-19]。近年的研究發(fā)現(xiàn),ToCV侵染寄主范圍不斷向其他經(jīng)濟(jì)作物擴(kuò)大,部分瓜類植物已逐漸成為T(mén)oCV新的自然宿主。2014年,Sun等[20]在山東省濟(jì)寧市的南瓜溫室內(nèi)首次檢測(cè)到ToCV的發(fā)生。2017年王天旗等[21]在湖南省蔬菜研究所基地的黃瓜植株上也發(fā)現(xiàn)了該病毒的危害。在我國(guó),瓜類蔬菜的栽培面積較大,ToCV的侵染將會(huì)對(duì)瓜類生產(chǎn)產(chǎn)生潛在的威脅。

2019年10月,在山東壽光現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高新技術(shù)試驗(yàn)示范基地60號(hào)溫室內(nèi)發(fā)現(xiàn)了疑似ToCV感染癥狀的西葫蘆葉片,背面伴有大量煙粉虱的發(fā)生。通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)明確了ToCV對(duì)西葫蘆的侵染及其在山東省西葫蘆種植區(qū)的發(fā)生情況,將為有效防控ToCV流行、擴(kuò)散提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年10月,在山東壽光現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高新技術(shù)試驗(yàn)示范基地西葫蘆栽培溫室內(nèi)發(fā)現(xiàn)9株疑似ToCV感病的植株,每株采集上、中、下3片葉,液氮速凍后置于-80℃冰箱用于病毒檢測(cè)。同時(shí),在疑似葉片背面采集煙粉虱成蟲(chóng)100頭,置于裝有95%乙醇的離心管中保存,用于病毒檢測(cè)。

為了調(diào)查山東省西葫蘆主產(chǎn)區(qū)ToCV病毒發(fā)生情況,2020年11月在濰坊壽光、濟(jì)南長(zhǎng)清區(qū)和德州德城區(qū)設(shè)施西葫蘆棚內(nèi)分別采集疑似ToCV感病樣品17、12份和20份,利用液氮速凍后置于-80℃冰箱,用于病毒檢測(cè)。同時(shí),在取樣溫室內(nèi)各采集煙粉虱成蟲(chóng)50頭,置入裝有95%乙醇的離心管中保存,用于病毒檢測(cè)。

1.2 感病植株ToCV的檢測(cè)

取植株葉片0.1 g放入研缽中,加液氮快速研磨,利用TRIzol Reagent法提取葉片總RNA,NanoDrop2000測(cè)定RNA濃度。RNA模板根據(jù)Thermo Scientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用于后續(xù)檢測(cè)。根據(jù)Dovas等[22]設(shè)計(jì)的ToCV特異性引物(ToCV-5:5′-GGTTTGGATTTTGGTACTACAT-

TCAGT-3′; ToCV-6: 5′-AAACTGCCTGCATGA-

AAAGTCTC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL,ddH2O 補(bǔ)充至反應(yīng)體系20 μL。按照94℃ 3 min;94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 1 min,循環(huán)30次;72℃ 10 min進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),回收目的片段連接到PMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,陽(yáng)性克隆委托北京華大基因科技有限公司測(cè)序,再進(jìn)行序列分析。

1.3 煙粉虱成蟲(chóng)ToCV的檢測(cè)

將從田間采集的單頭煙粉虱成蟲(chóng)置于RNA-free離心管中,加入10 μL TRIzol Reagent研磨提取RNA,采用ToCV特異性引物ToCV-5/6進(jìn)行PCR檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)3次,每次取10頭。

1.4 壽光西葫蘆溫室大棚ToCV發(fā)生規(guī)律和煙粉虱蟲(chóng)口數(shù)量調(diào)查

所調(diào)查的壽光西葫蘆大棚位于壽光現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高新技術(shù)試驗(yàn)示范基地內(nèi),于2020年9月5日定植,棚內(nèi)種植了58壟西葫蘆,壟向由北至南,北邊為土墻,南邊為塑料薄膜并裝有通風(fēng)用60目防蟲(chóng)網(wǎng);壟距為1.2 m、株距為0.8 m、每壟種植19～21株西葫蘆。

隨機(jī)選取20壟做病情調(diào)查,觀察植株生長(zhǎng)情況并分別在定植時(shí)和定植后的1個(gè)月、2個(gè)月和4個(gè)月統(tǒng)計(jì)具有ToCV癥狀的植株。

隨機(jī)選取6壟西葫蘆做煙粉虱數(shù)量調(diào)查,每壟由北向南的第5、10、15株和20株自上而下的第3片葉定時(shí)定葉觀察記錄煙粉虱數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

病情和蟲(chóng)口數(shù)量的數(shù)據(jù)以總的平均數(shù)來(lái)計(jì)算病株率和蟲(chóng)口數(shù)量。

利用統(tǒng)計(jì)軟件PASW Statistics18進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)不同處理間的差異進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似感病植株的田間癥狀

田間采集的疑似感病西葫蘆植株葉片的葉脈發(fā)綠,脈間出現(xiàn)不同程度的褪綠發(fā)黃,部分下部葉片變厚變脆,葉片邊緣呈現(xiàn)輕微卷曲(圖1),其表現(xiàn)的部分癥狀與ToCV引起的番茄植株的發(fā)病癥狀類似[17,19],且葉片背面發(fā)現(xiàn)煙粉虱,推測(cè)田間西葫蘆植株可能被ToCV侵染。溫室內(nèi)西葫蘆的葉片呈現(xiàn)不同的發(fā)病癥狀,伴隨果實(shí)出現(xiàn)綠色斑駁、凹凸不平,有可能存在其他多種病毒共同侵染的情況。

圖1 西葫蘆植株的病毒病癥狀Fig.1 Viral symptoms of zucchini plants

2.2 田間疑似樣品的ToCV檢測(cè)

利用ToCV的特異性引物對(duì)田間采集的9份疑似ToCV病毒病植株葉片進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),結(jié)果表明其中5份植株葉片均可檢測(cè)到463 bp的目的片段(圖2)。將特異性目的片段回收并連接到PMD18-T載體,挑單克隆菌落送華大基因科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI經(jīng)BLAST比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)該目的片段與GenBank中登錄的ToCV序列(登錄號(hào):KC887998.1)同源性高達(dá)99.58%,說(shuō)明該西葫蘆樣品已被ToCV侵染,檢測(cè)出的西葫蘆植株葉片表現(xiàn)ToCV典型癥狀。

圖2 疑似感病西葫蘆植株ToCV的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 RT-PCR testing results of ToCV in suspected infected zucchini plants

2.3 壽光西葫蘆溫室大棚ToCV發(fā)生動(dòng)態(tài)和煙粉虱蟲(chóng)口數(shù)量調(diào)查

選取20壟西葫蘆植株進(jìn)行ToCV感染植株調(diào)查后,根據(jù)ToCV典型癥狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,西葫蘆幼苗在定植時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)任何病毒病癥狀,但定植1個(gè)月后,有2%的植株表現(xiàn)ToCV癥狀,定植2個(gè)月后,表現(xiàn)癥狀的植株達(dá)到4.2%,定植4個(gè)月后,表現(xiàn)ToCV癥狀的植株率已高達(dá)68.2%,呈指數(shù)型的快速增長(zhǎng),其發(fā)病率與定植后的月數(shù)呈指數(shù)性相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.897,經(jīng)F雙樣本方差分析,其相關(guān)性在0.001水平上顯著(圖3)。

圖3 西葫蘆定植后不同月數(shù)里顯示ToCV類似癥狀的植株率及其相關(guān)性Fig.3 ToCV symptomatic plant rate at different time points (month)after planting and their correlation

溫室內(nèi)西葫蘆植株上煙粉虱蟲(chóng)口數(shù)量共調(diào)查5次,分別是在2020年10月26日、10月28日、11月3日、11月10日和2021年1月5日進(jìn)行。結(jié)果表明,在第一次調(diào)查時(shí)煙粉虱蟲(chóng)口數(shù)量最大,所調(diào)查植株第3葉的平均蟲(chóng)口數(shù)量達(dá)到12.4頭,最大的蟲(chóng)口數(shù)量出現(xiàn)在最靠近南邊防蟲(chóng)網(wǎng)的第20株西葫蘆上，為41.7頭(圖4)。由于蟲(chóng)口數(shù)量較大,10月27日在南端的5株西葫蘆葉片正反兩面噴施無(wú)公害生物制劑CitruSolv?C-100 50倍液(Global BioClean Inc., Bredenton, Florida, USA)進(jìn)行了區(qū)域性綠色防控。在10月28日的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),第20株上的蟲(chóng)口數(shù)量下降到11.7頭,且后續(xù)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),其平均蟲(chóng)口數(shù)量保持在5.5～7.7頭。從溫室內(nèi)所調(diào)查植株第3葉的煙粉虱平均蟲(chóng)口數(shù)量看,噴施無(wú)公害生物制劑C-100防控?zé)煼凼蟮?次調(diào)查中,平均蟲(chóng)口數(shù)量變化不大,維持在3.5頭左右(圖4)。

圖4 不同調(diào)查日期西葫蘆植株第3葉上的煙粉虱平均蟲(chóng)口數(shù)量Fig.4 Average numbers of Bemisia tabaci on the 3rd leaf of zucchini plants at different survey dates

2.4 不同地區(qū)植株帶毒情況檢測(cè)

為了調(diào)查T(mén)oCV對(duì)山東省各地西葫蘆的侵染情況,我們?cè)跒H坊壽光、濟(jì)南長(zhǎng)清和德州德城分別采集疑似ToCV病毒感染樣品17、21、20份。利用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),3個(gè)地區(qū)的樣品均可獲得463 bp的特異性擴(kuò)增片段,與陽(yáng)性對(duì)照一致,說(shuō)明這些樣品中含有ToCV。在采集的各地樣品中,濰坊壽光地區(qū)的ToCV檢出率最高,為52.9%;濟(jì)南為32%;德州為29.1%,這說(shuō)明ToCV在山東上述地區(qū)的西葫蘆種植中可能已普遍發(fā)生(圖5)。

圖5 山東省不同地區(qū)西葫蘆樣品的ToCV帶毒情況Fig.5 Detection rates of ToCV in zucchini samples from different areas in Shandong

2.5 煙粉虱體內(nèi)ToCV帶毒情況檢測(cè)

在濰坊壽光、濟(jì)南長(zhǎng)清和德州德城的疑似發(fā)病植株上各采集煙粉虱成蟲(chóng)10頭,提取單頭煙粉虱的RNA,重復(fù)3次。利用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),3個(gè)地區(qū)的煙粉虱體內(nèi)均可檢測(cè)到463 bp的特異性片段(圖6),與陽(yáng)性對(duì)照一致,表明煙粉虱體內(nèi)攜帶ToCV病毒。其中,濰坊壽光溫室內(nèi)采集的煙粉虱帶毒率為56.7%,濟(jì)南長(zhǎng)清為41.5%,德州為48.1%(圖7)。

圖6 部分煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)ToCV的 RT-PCR檢測(cè)Fig.6 RT-PCR detection of ToCV in some Bemisia tabaci adults

圖7 煙粉虱成蟲(chóng)ToCV檢出率Fig.7 Detection rates of ToCV in Bemisia tabaci adults

3 討論

ToCV是世界范圍內(nèi)發(fā)生的一種新興植物病毒,主要危害番茄、茄子等茄果類蔬菜。由于媒介昆蟲(chóng)的暴發(fā)流行,該病毒也不斷擴(kuò)大其地理和宿主范圍[17],成為蔬菜安全生產(chǎn)的新威脅。本研究于2019年10月在山東壽光的西葫蘆暖棚內(nèi)發(fā)現(xiàn)疑似ToCV癥狀的發(fā)病植株,該植株上的顯癥葉片經(jīng)RT-PCR檢測(cè)后確認(rèn)感染了ToCV。通過(guò)對(duì)濰坊壽光、濟(jì)南長(zhǎng)清和德州德城的西葫蘆設(shè)施種植區(qū)采樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ToCV的檢出率均在29%以上,這說(shuō)明該病毒病在山東省3個(gè)設(shè)施西葫蘆主產(chǎn)區(qū)已普遍發(fā)生,但對(duì)露天種植及其他設(shè)施種植區(qū)的危害情況還需進(jìn)一步調(diào)查。研究發(fā)現(xiàn),ToCV極易與多種植物病毒發(fā)生復(fù)合侵染,如番茄黃化曲葉病毒tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)[23]、番茄斑萎病毒tomato spotted wilt virus(TSWV)[24]、番茄侵染性褪綠病毒tomato infectious chlorosis virus(TICV)[25]等。多種病毒的復(fù)合侵染一般會(huì)產(chǎn)生拮抗或協(xié)生作用,而協(xié)生作用往往有利于突破寄主抗性,導(dǎo)致新的病害發(fā)生和流行[26]。Tang等[27]在海南番茄和黃瓜溫室周邊的雜草上檢測(cè)到ToCV和瓜類褪綠病毒cucurbit chlorotic yellows virus(CCYV)的復(fù)合侵染。本研究采集的西葫蘆樣品疑似感染病毒病癥狀存在一定差異,利用特異性引物發(fā)現(xiàn)部分樣品被粉虱傳播的瓜類褪綠病毒cucurbit chlorotic yellows virus(CCYV)和蚜蟲(chóng)傳播的黃瓜花葉病毒cucumber mosaic virus(CMV)侵染(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。研究發(fā)現(xiàn),病毒的復(fù)合侵染會(huì)提高媒介昆蟲(chóng)對(duì)病毒的傳毒效率,促進(jìn)病毒在田間的傳播[28]。因此,對(duì)瓜類蔬菜進(jìn)行ToCV監(jiān)測(cè)將有利于控制該病毒的發(fā)生和流行,阻止其寄主范圍的擴(kuò)大。

ToCV是韌皮部限制性病毒,自然條件下,依靠媒介昆蟲(chóng)煙粉虱、溫室白粉虱Trialeurodesvaporariorum和紋翅粉虱T.abutilonea的口針刺破植物韌皮部細(xì)胞以半持久性方式進(jìn)行傳播[2,29-30]。在我國(guó),煙粉虱已經(jīng)逐漸取代了溫室白粉虱,成為田間的優(yōu)勢(shì)種群[31]。本研究發(fā)現(xiàn)西葫蘆棚內(nèi)采集的煙粉虱攜帶ToCV病毒的概率高達(dá)40%,是ToCV傳播的主要傳毒介體。從ToCV感病植株和煙粉虱蟲(chóng)口數(shù)量調(diào)查的數(shù)據(jù)上看,調(diào)查后期棚內(nèi)西葫蘆ToCV發(fā)病率呈指數(shù)式快速增長(zhǎng),而蟲(chóng)口數(shù)量在這個(gè)階段維持較低密度。由此可見(jiàn),ToCV病毒病一旦在西葫蘆溫室中發(fā)生,該病毒并不需要較大的蟲(chóng)口數(shù)量就能迅速蔓延并造成嚴(yán)重危害。這種情況與煙粉虱傳毒效率高、遷飛性強(qiáng)有關(guān),也極有可能和農(nóng)事操作、人工采果對(duì)煙粉虱造成驚擾等因素有關(guān)。

黃瓜、西葫蘆等瓜類蔬菜是山東省設(shè)施農(nóng)業(yè)的特色支柱產(chǎn)業(yè)之一,而瓜類蔬菜病毒病的普遍發(fā)生已經(jīng)成為制約高品質(zhì)高產(chǎn)量瓜類生產(chǎn)的重要因素[32]。且設(shè)施西葫蘆的環(huán)境因素相對(duì)穩(wěn)定,一旦煙粉虱和瓜果蔬菜的病毒病同時(shí)發(fā)生,如果不加以有效的控制,其病情很可能在短期內(nèi)迅速發(fā)展并造成極大的危害。因此,設(shè)施內(nèi)種植瓜果蔬菜的過(guò)程中,農(nóng)戶們應(yīng)該認(rèn)識(shí)到病毒病一旦發(fā)生后的嚴(yán)重性,嚴(yán)格選用無(wú)病毒無(wú)蟲(chóng)媒種苗,完善和使用能夠有效地阻斷粉虱和其他遷飛性害蟲(chóng)進(jìn)入的防蟲(chóng)網(wǎng),定期在棚內(nèi)進(jìn)行病蟲(chóng)害調(diào)查,及時(shí)采取措施防止病蟲(chóng)害的發(fā)生和蔓延,真正地做到防患于未然。