楊玉文, 喬 培, 劉德華, 費諾亞, 關 巍, 趙廷昌*

(1. 中國農業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193; 2. 吉林農業(yè)大學, 長春 130118; 3. 沈陽農業(yè)大學, 沈陽 110866)

瓜類細菌性果斑病(bacterial fruit blotch, BFB)是瓜類作物上重要的種傳細菌性病害,病原菌為西瓜噬酸菌Acidovoraxcitrulli[1]。該病害在世界多個國家發(fā)生,主要危害葉片和果實,嚴重影響西瓜、甜瓜等葫蘆科作物的產量和質量[2],同時阻礙西瓜、甜瓜種子產業(yè)的健康發(fā)展[3-4]。Somodi等[5]首次提出西瓜噬酸菌存在多樣性。之后,各國學者紛紛對世界各地西瓜噬酸菌的種內遺傳多樣性進行了分析,將所有供試菌株分成了至少兩個組[6-10],Ⅰ組的菌株主要分離自甜瓜及南瓜等寄主,Ⅱ組的菌株主要分離自西瓜。西瓜噬酸菌兩個組的菌株在致病力和抗銅性等方面存在較多差異。Ⅰ組菌株對甜瓜和西瓜均具有較強的致病力,而Ⅱ組菌株對西瓜的致病力較強,對甜瓜的致病力較弱[7];Ⅰ組菌株對硫酸銅的敏感性明顯低于Ⅱ組菌株[11]。了解西瓜噬酸菌對銅制劑敏感性的差異對田間防治過程中銅制劑的施用量具有重要的指導意義。因此,快速準確地區(qū)分Ⅰ組和Ⅱ組菌株對該病害的綜合防治非常重要。

西瓜噬酸菌是我國進境植物檢疫性有害生物之一,種子帶菌是其最主要的初侵染源和遠距離傳播的重要途徑,健康種子種苗生產是病害防治的重要手段,而快速準確的檢測則是保證種子種苗健康的重要技術措施。目前,關于西瓜噬酸菌的檢測大多局限于種的水平。根據(jù)16S rDNA[6,12-13]、Aave_4063和Aave_4064基因[14]、BOX-PCR片段[15]、hrpB2基因[16]序列設計特異性引物,能夠有效地將其他植物病原細菌與西瓜噬酸菌區(qū)分開來。免疫學技術也已經廣泛運用于西瓜噬酸菌的種間檢測,單克隆抗體免疫磁珠吸附與PCR相結合的技術[6]、選擇性培養(yǎng)基富集結合PCR形成的BIO-PCR技術[17]大大提高了檢測的靈敏度;膠體金免疫層析法與PCR相結合的GICA-PCR檢測技術[18]能夠在蛋白和核酸兩個層面上進行病原菌的檢測。關于西瓜噬酸菌種內分組檢測的研究僅在近年來有少量報道,根據(jù)pilL基因[19]、Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應子基因Aave_2166[20]、pilA基因[21]序列的差異設計的種內引物可區(qū)分西瓜噬酸菌的兩個組。然而,這3個種內分組方法均僅用于種內分組的檢測,研究并沒有報道這些分組引物對西瓜噬酸菌與其他植物病原菌尤其是西瓜噬酸菌近緣種的區(qū)分情況。按照目前的檢測方法,西瓜噬酸菌檢測到不同的組需要兩個步驟,即先確定是否為西瓜噬酸菌,再區(qū)分其分組情況,過程較為復雜,費時費力。因此,建立一個能夠通過一次PCR直接確定西瓜噬酸菌且準確分組的檢測技術體系是非常必要的。

本研究擬將西瓜噬酸菌的種特異性引物和分組特異性引物組合起來,建立和優(yōu)化一個能夠一步檢測西瓜噬酸菌且準確分組的多重PCR體系。通過對帶菌種子浸出液、感病葉片和果實等植物組織進行直接檢測,證實該多重PCR體系在生產上的準確性和可靠性,使瓜類細菌性果斑病的早期診斷更加省時省力且快速準確。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究所用的21株供試菌株均為本實驗室保存,其中西瓜噬酸菌A.citrulli10株,其他常見植物病原細菌及西瓜噬酸菌近緣種11株,菌株的具體信息見表1。

表1 本研究所用的供試菌株Table 1 The bacterial strains used in this study

1.2 主要試劑和儀器

KOD DNA 聚合酶購自東洋紡(上海)生物科技有限公司;DNA Marker 2000+ 購自北京博邁德生物技術有限公司;抗生素購自Sigma公司;引物合成由北京六合華大基因有限公司完成。主要儀器:恒溫培養(yǎng)箱(Thermo),搖床(上海智誠),超凈工作臺(上海智誠),紫外分光光度計(Thermo),PCR擴增儀(ABI),電泳儀(北京六一儀器廠),凝膠成像儀(BIO-RAD),超低溫冰箱(SONY)。

1.3 培養(yǎng)基和菌株培養(yǎng)條件

西瓜噬酸菌于KB (Ampr)固體培養(yǎng)基(蛋白胨20 g,瓊脂15 g,K2HPO41.5 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,丙三醇15.0 mL;加去離子水至1 L,pH=7.0)上28℃培養(yǎng)48～60 h;挑取單菌落于KB液體(Ampr) 培養(yǎng)基,28℃,200 r/min培養(yǎng)過夜。菌液調OD600=0.3(約108cfu/mL)備用。培養(yǎng)基中氨芐青霉素(ampicillin)的工作濃度為100 μg/mL。

1.4 多重PCR擴增體系的建立與優(yōu)化

多重PCR體系所用引物是由Yang 等[21]的西瓜噬酸菌分組引物和Bahar等[15]的西瓜噬酸菌種特異性引物組合建立的。其中,種內分組引物BFB/BFB1/BFB2是根據(jù)西瓜噬酸菌不同組pilA基因的差異設計的,通過擴增片段的大小來分組;BX-L1/BX-S-R2為西瓜噬酸菌的種特異性引物。引物具體信息見表2。

表2 西瓜噬酸菌分組檢測所用引物信息Table 2 Information of primers for grouping Acidovorax citrulli

PCR擴增條件:95℃ 3 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 40 s,35個循環(huán);72℃延伸7 min;4℃保存。

試驗對引物的濃度進行了優(yōu)化,共設9個處理,每條引物的量如表3所示。反應體系(25 μL):10×PCR buffer 2.5 μL,dNTPs 2.5 μL,MgSO41.5 μL,KOD酶0.5 μL,5×GC enhancer 5 μL,BFB/BFB1/BFB2引物每條1 μL,BX-L1/BX-S-R2引物每條0.3 μL,模板菌液1.0 μL,超純水補足至25 μL。取5 μL擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,100 V下電泳45 min,采用Bio-Rad公司的凝膠分析系統(tǒng)進行照相分析。

表3 多重PCR擴增體系引物濃度優(yōu)化Table 3 Optimization of primer concentration in the multiplex PCR assay

1.5 多重PCR的特異性檢測

以西瓜噬酸菌Ⅰ組、Ⅱ組菌株、其他植物病原細菌及西瓜噬酸菌近緣種(表1)菌液為模板,按照1.4中的擴增條件和優(yōu)化后反應體系進行PCR擴增,檢測體系的特異性。

1.6 多重PCR的靈敏度檢測

選取西瓜噬酸菌Ⅰ組菌株pslb65和Ⅱ組菌株Aac5進行多重PCR的靈敏度檢測。分別將兩個菌株菌液濃度稀釋為10～108cfu/mL,以其作為模板,按照1.4的擴增條件和優(yōu)化后的反應體系進行PCR擴增,檢測體系的靈敏度。

1.7 帶菌種子檢測

取10 μL 濃度為108cfu/mL 的Ⅰ組菌株pslb65菌液滴于甜瓜種子上,取10 μL 濃度為108cfu/mL 的Ⅱ組菌株Aac5菌液滴于西瓜種子上。每種菌液分別接種25粒種子,置于超凈工作臺中過夜陰干。自然帶菌西瓜種子由北京市農林科學院和吉林農業(yè)大學惠贈,各取25粒進行檢測。

取1 mL 超純水于2 mL離心管中,放入1粒人工接菌或自然帶菌的甜瓜或西瓜種子,28℃ 200 r/min振蕩1 h。取上清液作為待測PCR模板,按照1.4的擴增條件和優(yōu)化后的反應體系進行PCR擴增檢測。

1.8 植物感病組織PCR檢測

分別采集海南省自然感病的甜瓜葉片和果實各1份,以及吉林省的西瓜葉片和果實各1份。剪取自然感病的西瓜或甜瓜病健交界處1 cm2見方的葉片或果實,將其浸泡于75%乙醇,表面消毒2 min,無菌水清洗3次,放入2 mL離心管中,加入800 μL無菌水,玻璃棒充分研磨后靜置30 min,取上清作為待測PCR模板。將200 mL 濃度為108cfu/mL的Ⅰ組代表菌株pslb65和Ⅱ組代表菌株Aac5,分別人工噴霧接種于出苗15 d的西瓜、甜瓜苗,7 d后取感病葉片病健交界處1 cm2見方的葉片,按照上述方法處理后作為待測模板。按照1.4的擴增條件和優(yōu)化后的反應體系進行PCR擴增,使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果。

1.9 西瓜、甜瓜種苗的帶菌檢測

用5×105cfu/mL的pslb65和Aac5菌液分別浸泡甜瓜和西瓜種子各50粒,30 min后將種子取出,在超凈工作臺中過夜陰干。將晾干的甜瓜和西瓜種子分別種在直徑10 cm的盆中,每盆5棵,放置于光照培養(yǎng)箱中,25℃光照12 h,18℃黑暗12 h,相對濕度90%。自子葉出土起,每日各取甜瓜和西瓜3株,每片子葉用直徑5 mm的打孔器隨機打孔2個,分別將打孔所得西瓜和甜瓜子葉樣品置于2 mL離心管中,加800 μL無菌水研磨,取上清液為待測模板。按照1.4的方法進行多重PCR擴增,電泳觀察檢測結果。試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 多重PCR體系的構建

本研究將西瓜噬酸菌特異性引物BX-L1/BX-S-R2和分組引物BFB/BFB1/BFB2組合成一個多重PCR體系,以Ⅰ組代表菌株pslb65、Ⅱ組代表菌株Aac5為模板進行PCR擴增,結果顯示:Ⅰ組代表菌株pslb65產生了兩個條帶,一個是西瓜噬酸菌的特異性條帶(279 bp),一個是Ⅰ組菌株的特異條帶(348 bp);Ⅱ組代表菌株Aac5同樣產生了兩個條帶,一個是西瓜噬酸菌的特異性條帶(279 bp),另一個是Ⅱ組菌株的特異條帶(507 bp);pslb65和Aac5等量混合后擴增產生了3個條帶,第一個是西瓜噬酸菌的特異性條帶(279 bp),第二個是Ⅰ組菌株的特異條帶(348 bp),第三個是Ⅱ組菌株的特異條帶(507 bp),3個條帶清晰可見,能夠較好地區(qū)分開來。將多重PCR的擴增結果與兩組引物單獨擴增的結果相比較,各條帶大小一致,能夠很好地相互區(qū)分。說明由西瓜噬酸菌特異性引物BX-L1/BX-S-R2和西瓜噬酸菌分組引物BFB/BFB1/BFB2構成的該多重PCR是穩(wěn)定可行的。

圖1 多重PCR對兩組西瓜噬酸菌的擴增結果Fig.1 Amplification results of two groups of Acidovorax citrulli strains by the multiplex PCR assay

2.2 多重PCR體系引物配比的優(yōu)化

為了減少多條引物之間的相互干擾,實現(xiàn)良好的擴增效果,本研究對體系中的引物濃度進行了優(yōu)化。BX-L1/BX-S-R2采用每條引物0.7、0.5、0.3 μL 3個濃度梯度,BFB/BFB1/BFB2 采用每條引物1、1.2、1.5 μL 3個濃度梯度,共有T1～T99個處理(具體引物濃度見表3)。模板分別為Ⅰ組代表菌株pslb65、Ⅱ組代表菌株Aac5和兩者等比例混合菌液,不同處理的PCR結果如圖2所示。從PCR結果可以看出,T1、T2、T3處理均具有較好的擴增效果,考慮到T3處理(BFB/BFB1/BFB2 每條引物1 μL,BX-L1/BX-S-R2每條引物0.3 μL)引物的用量低,因此認為T3處理的引物濃度最為合適。

圖2 多重PCR體系引物配比的優(yōu)化結果Fig.2 Optimization of primers in the multiplex PCR assay

2.3 多重PCR體系特異性檢測結果

使用該多重PCR體系對10株不同組的西瓜噬酸菌和11株其他植物病原細菌進行擴增,結果(圖3)表明:測試的5株西瓜噬酸菌Ⅰ組菌株均出現(xiàn)2條特異條帶,一條為西瓜噬酸菌的279 bp的特異性條帶,另一條為Ⅰ組菌株特異條帶(348 bp)。測試的5株西瓜噬酸菌Ⅱ組菌株均出現(xiàn)2條特異性條帶,一條為西瓜噬酸菌的279 bp的特異性條帶,另一條為Ⅱ組菌株特異條帶(507 bp)。在3個近緣種中,3183擴增出1條348 bp的條帶,而沒有出現(xiàn)279 bp的西瓜噬酸菌特異條帶,其他兩個近緣種2826、7733均無擴增條帶;8個其他屬的植物病原菌也均未擴增到條帶。試驗結果說明該多重PCR能夠特異性地擴增西瓜噬酸菌,同時實現(xiàn)種內亞組的區(qū)分。

圖3 多重PCR對不同組西瓜噬酸菌的特異性擴增結果Fig.3 Specific amplification results of the multiplex PCR assay for different groups of Acidovorax citrulli

2.4 多重PCR的靈敏度檢測結果

從圖4可以看出,菌液模板濃度為105cfu/mL時,Ⅰ組和Ⅱ組菌株均有較清晰的擴增條帶,在104cfu/mL時,果斑病特異條帶仍然清晰可見,而分組的特異條帶則較為模糊,綜合兩者,認為該多重PCR體系對于西瓜噬酸菌菌液分組的檢測靈敏度為105cfu/mL。

圖4 多重PCR對不同組西瓜噬酸菌菌株的靈敏度檢測結果Fig.4 Sensitivity detection results of the multiple PCR assay for different groups of Acidovorax citrulli

2.5 種子帶菌檢測結果

帶菌種子檢測結果如圖5所示,所有帶菌的種子,無論是接種Ⅰ組代表菌株pslb65、Ⅱ組代表菌株Aac5,還是田間自然帶菌種子,均有清晰的特異性擴增條帶。pslb65菌液接種的甜瓜種子檢測結果顯示,均擴增出279 bp和348 bp兩個條帶;Aac5菌液接種的西瓜種子檢測結果顯示,均擴增出279 bp和507 bp兩個條帶;來自北京和吉林的兩份自然帶菌的西瓜種子的檢測結果顯示,均得到清晰的西瓜噬酸菌279 bp特異條帶和Ⅱ組菌株的507 bp的特異條帶,說明這2份自然帶菌種子樣品均為西瓜噬酸菌Ⅱ組菌株侵染。試驗結果證實了該檢測技術能夠檢測出單粒的人工接菌種子和田間自然帶菌的種子,具有一定的應用潛力。

圖5 多重PCR對攜帶不同組西瓜噬酸菌種子的檢測結果Fig.5 Results of multiplex PCR assays for two groups of Acidovorax citrulli using bacteria-carrying seeds

2.6 西瓜、甜瓜病組織帶菌檢測結果

對采集自海南省和吉林省自然發(fā)病的甜瓜和西瓜葉片和果實的病組織研磨液直接檢測,結果表明:采集自海南省甜瓜的葉片和果實均擴增出西瓜噬酸菌特異條帶和Ⅰ組特異條帶;采集自吉林省西瓜的葉片和果實均擴增出西瓜噬酸菌特異條帶和Ⅱ組特異條帶。pslb65和Aac5分別人工噴霧接種的甜瓜和西瓜葉片均能檢測到各自的特異性條帶(圖6)。說明,該多重PCR體系能夠在寄主感病組織中檢測到西瓜噬酸菌,并準確分組。

圖6 多重PCR對甜瓜、西瓜感病葉片和果實中攜帶不同組西瓜噬酸菌的檢測結果Fig.6 Results of multiplex PCR assays differentiating Acidovorax citrulli groups in infected fruit and leaf tissues of melon and watermelon

2.7 西瓜、甜瓜種苗帶菌檢測結果

甜瓜種子人工接菌之后,出苗后第3天開始出現(xiàn)水漬狀病斑,第4天開始出現(xiàn)壞死病斑(圖7)。多重PCR的檢測結果顯示:從出苗后第2天的甜瓜子葉研磨液中就可擴增出清晰的西瓜噬酸菌特異條帶,出苗第3天的子葉中全部檢出西瓜噬酸菌且均為Ⅰ組菌株(圖9)。

圖7 西瓜噬酸菌Ⅰ組菌株pslb65接種甜瓜種子出苗后的子葉癥狀Fig.7 Cotyledon symptoms of melon seedlings inoculated with Acidovorax citrulli group Ⅰ strain pslb65

西瓜種子人工接菌之后,出苗第4天開始出現(xiàn)水漬狀病斑,第5天開始出現(xiàn)壞死病斑(圖8)。多重PCR檢測結果顯示:從接種后第3天的子葉研磨液中可擴增出西瓜噬酸菌特異條帶,出苗第4天的西瓜子葉中全部檢出西瓜噬酸菌且均為Ⅱ組菌株(圖9)。

圖8 西瓜噬酸菌Ⅱ組菌株Aac5接種西瓜種子出苗后的子葉癥狀Fig.8 Cotyledon symptoms of watermelon seedlings inoculated with Acidovorax citrulli group Ⅱ strain Aac5

圖9 帶菌種子出苗后子葉多重PCR檢測結果Fig.9 Results of multiplex PCR assays in sweet melon and watermelon cotyledons from contaminated seeds

3 討論

瓜類細菌性果斑病是西瓜、甜瓜等葫蘆科作物上最重要、危害最嚴重的病害之一,每年對我國的西瓜、甜瓜產業(yè)造成巨大的經濟損失,同時影響著我國西瓜、甜瓜種業(yè)的健康發(fā)展。其病原菌西瓜噬酸菌是我國進境植物檢疫性有害生物,快速準確的檢測和分組是保證我國西瓜、甜瓜產業(yè)健康發(fā)展的重要技術措施。

目前,西瓜噬酸菌的分組檢測報道較少,其中,Zhong等[19]利用基于pilL基因的特異引物，通過Ⅱ組菌株產生擴增條帶,而Ⅰ組菌株無擴增來區(qū)分兩組菌株。Zivanovic等[20]利用引物G2AcFwd/G12AcRev可從Ⅱ組菌株AAC00-1中擴增出291 bp的片段,利用引物G12AcFwd/G12AcRev可從Ⅰ組菌株M6和Ⅱ組菌株AAC00-1得到254 bp的片段,由于兩個條帶大小相近,很難區(qū)分。因此,這兩組引物不適用于本研究擬建立的多重PCR體系來一步檢測西瓜噬酸菌并準確分組。Yang等[21]篩選出BFB/BFB1/BFB2/BFB3引物組,建立了一個多重PCR體系,根據(jù)條帶的大小差異,能夠將西瓜噬酸菌分成3個組,具有很好的特異性和穩(wěn)定性。在實際的檢測應用中,本研究考慮到第3組菌株的數(shù)量非常少,且均為同一年分離自同一地區(qū)的不同地塊,在實際生產中意義較小,同時考慮到多重PCR體系中引物之間的相互影響,為了保證多重PCR的穩(wěn)定性和靈敏度,本研究只選取了Ⅰ組和Ⅱ組的特異性引物,而沒有加入Ⅲ組特異性引物。BFB/BFB1/BFB2/BFB3引物組構建的多重PCR體系的缺陷是燕麥噬酸菌同Ⅰ組菌株一樣也能產生348 bp的條帶,從而不能與Ⅰ組菌株區(qū)分開來。為了彌補這一缺陷,本研究在西瓜噬酸菌特異性引物的選擇中,首先考慮了能否很好地區(qū)分西瓜噬酸菌與燕麥噬酸菌等近緣種,同時考慮擴增條帶的大小要與分組特異性引物的條帶有一定的差異,使鑒定結果有較好的區(qū)分度。鑒于此,本研究選取了引物BX-L1/BX-S-R2[15],能夠將西瓜噬酸菌及其近緣種很好地區(qū)分開來,且條帶大小為279 bp,與Yang等[21]Ⅰ組特異條帶的348 bp和Ⅱ組特異條帶的507 bp有比較好的區(qū)分度。本研究為了實現(xiàn)帶菌種子和田間感病組織的直接檢測,在多重PCR建立和優(yōu)化的過程中,擴增模板均為不同植物病原細菌純培養(yǎng)的菌液,并沒有進行預處理,這可能是造成檢測靈敏度偏低的原因之一。

在測試樣品的選擇中,本研究分別選擇了西瓜噬酸菌Ⅰ組和Ⅱ組菌株各5株,每組菌株均分離自西瓜和甜瓜兩種寄主,區(qū)域來源于我國不同的省份,包括新疆、內蒙古、山東、海南、臺灣、黑龍江、廣東等省區(qū),且Ⅰ組和Ⅱ組均有一株來自國外的菌株。3株西瓜噬酸菌的近緣種為燕麥噬酸菌、卡特萊蘭噬酸菌和魔芋噬酸菌,還選擇了包括假單胞菌、黃單胞菌等8個其他屬的常見植物病原細菌。因此,樣品的選擇具有典型性和全面性。

瓜類細菌性果斑病為種傳細菌性病害,種子種苗帶菌是其最重要的初侵染源,種子種苗帶菌與否對當年的產量有著至關重要的影響。因此,帶菌種子種苗的快速準確檢測對西瓜、甜瓜產業(yè)的健康發(fā)展尤為重要。該多重PCR體系能夠直接從帶菌種子浸泡液或寄主植物感病組織研磨液中檢測到病原細菌,省略了細菌從種子或寄主組織中分離再純培養(yǎng)的過程,有效地縮短2～3 d的檢測時間。通過對人工接菌和自然帶菌的單粒種子的檢測,證實了多重PCR體系的特異性、準確性和穩(wěn)定性,同時苗期檢測試驗結果表明,子葉不顯癥的時候就能夠檢測到病菌的存在,且準確分組,這將為病害的早期防控爭得寶貴的時間。多重PCR檢測體系的建立將為果斑病的快速診斷提供新的技術支撐。