凌 彬, 紀 穎, 白 云, 朱家君, 陳思宇,李紫溢, 段 可, 高清華

(1. 上海海洋大學食品學院, 上海 201306; 2. 上海市農業(yè)科學院林木果樹研究所, 上海 201403; 3. 上海應用技術大學生態(tài)技術與工程學院, 上海 201418)

炭疽菌屬ColletotrichumCorda真菌隸屬于真菌門Eumycota,半知菌亞門Deuteromyeotina,腔孢綱Coelomycetes,黑盤孢目Melanconiales,黑盤孢科Melanconiaceae[1]。其種類繁多,寄主廣泛,可侵染多種水果、蔬菜和糧食作物,給各類經濟作物帶來巨大的災難。草莓Fragaria×ananassaDuch.葉柄、枝干、匍匐莖、花和果實等都可被炭疽菌侵染[2]。病原菌一旦侵入草莓植株,在適宜的溫濕度條件下可迅速擴散,給草莓育苗和生產帶來毀滅性的危害。草莓炭疽病的防控措施以農業(yè)防治、化學防治、生物防治為主[2],但是這些方法都具有一定的局限性,特別是農藥的長期使用不僅給生態(tài)環(huán)境和食品安全帶來極大威脅,而且會導致炭疽菌的抗藥性增加[3]。因此,找到一種環(huán)境友好且行之有效的炭疽病防治措施是現(xiàn)今亟待解決的問題。

太陽光譜中紫外線(ultraviolet,UV)根據(jù)波長大小分為3個區(qū)間:UV-A (315～400 nm)、UV-B (280～315 nm)、UV-C (100～280 nm)[4]。在這3個波段中,只有UV-A和UV-B能夠到達地球表面,而UV-C由于大氣中的臭氧層可大幅度降低波長小于320 nm輻射的穿透能力則完全無法透過[5]。UV-A和UV-B主要影響生物的形態(tài)發(fā)生和向光性,UV-B和UV-C能激發(fā)次生代謝物產生;3類紫外線以UV-C輻照能量最高。UV-C對生物的影響分直接和間接兩類,直接效應包括DNA傷害、蛋白多聚化、酶失活、細胞膜通透性增加等,間接效應主要有提高活性氧粒子ROS的積累,增加包括酚類在內的次生代謝物積累[6]。紫外線輻照對真菌的孢子萌發(fā)、存活、繁殖、分布、擴散、致病性和毒性都有重要影響。UV-C輻照對病原微生物的影響與劑量相關,致死劑量的輻照可以直接滅活大部分的分生孢子;亞致死劑量的輻照可降低分生孢子的萌發(fā)速度,從而降低毒力;更低且適宜劑量的紫外照射可促使病原菌產孢、有利于病原擴散[7]。病原真菌不同細胞結構對紫外線輻照的耐受力不同,一般孢子耐受性比菌絲強,且孢子的形態(tài)和代謝產物等影響其耐受力,體積大、色素積累多的真菌孢子比小的、透明的真菌孢子更耐受UV輻射[8]。此外,菌絲生長過程環(huán)境中物理、化學、營養(yǎng)等條件也影響所產孢子對包括紫外線在內多種脅迫的耐受性,這是因為環(huán)境因子顯著影響微生物自我修復進程[9]。比如,微生物經紫外輻照后普遍存在光修復,在球孢白僵菌Beauveriabassiana對UV-C輻照響應研究中,對UV-C誘導形成的環(huán)丁烷嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimers, CPD)定量分析發(fā)現(xiàn),480 J/m2劑量的UV-C輻照下形成 CPD數(shù)量為15個/10 kb,在進一步培養(yǎng)中,球孢白僵菌通過光修復和核酸切除修復可顯著降低每10 kb形成CPD的數(shù)量[10]。

研究表明,低劑量UV-B 輻照能夠促進膠孢炭疽菌C.gloeosporioides的菌絲生長和孢子萌發(fā)；當UV-B不直接作用于炭疽菌而是直接輻照到蘋果上,可誘導抗氧化防御系統(tǒng)過氧化氫酶活性,限制炭疽病斑擴展，使蘋果的抗病性增強[11]。高劑量UV-B輻照對尖孢炭疽菌C.acutatum的生長有抑制作用,并隨著輻照時間的增加而加強;紫外照射結束后光照培養(yǎng)12 h炭疽菌分生孢子存活率比持續(xù)黑暗培養(yǎng)高;不同菌株對UV-B敏感性存在差異,即使完全一致的生境中分離的尖孢炭疽菌不同菌株,其孢子對UV-B輻照的耐受性也可能存在顯著差異[12]。美國農業(yè)部下屬阿巴拉契亞果樹研究實驗站利用55 W的紫外燈在30 cm上方照射，分析UV-C對兩種草莓炭疽病病原孢子生長的影響,結果表明，紫外輻照后可見光下培養(yǎng)要完全抑制尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌生長分別需要紫外輻照60 s和90 s,而如果紫外輻照后黑暗培養(yǎng)4 h以上則分別僅需紫外輻照45 s和60 s就可徹底抑制兩種孢子發(fā)展為菌落[13]。但這些研究都沒有進一步的量化比較。此外,在我國大陸和臺灣地區(qū)對草莓危害嚴重的是膠孢炭疽菌復合種下的3種菌:暹羅炭疽菌C.siamense、果生炭疽菌C.fructicola和膠孢炭疽菌C.gloeosporioides[14-17], 前兩種優(yōu)勢菌種對UV-C的耐受性尚無報道。因此,UV-C如何影響我國草莓炭疽病優(yōu)勢病原菌生長和致病力,不同炭疽菌對UV-C的反應有何差異,值得進一步探究。

本文以果生炭疽菌、膠孢炭疽菌、暹羅炭疽菌為材料,研究了UV-C照射對其分生孢子的相對存活率、產孢能力、菌絲生長和對草莓葉片致病力的影響。本研究可為我國草莓炭疽病的非化學農藥控制新途徑探索、延緩炭疽菌對殺菌劑的耐藥性、推進草莓綠色生態(tài)栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、草莓材料

膠孢炭疽菌復合種Colletotrichumgloeosporioidessensulato(complex/aggregate)是我國大部分草莓產區(qū)炭疽病的主要致病菌。供試菌株分別為CGMCC3.17371(C.fructicola,分離自上海青浦草莓病樣[18])、Jsh-7-1(C.gloeosporioides,分離自武漢草莓病樣)、Nj-2(C.siamense,分離自南京草莓病樣)[14]。供試草莓為易感炭疽病的‘黃毛草莓’Fragarianilgerrensis無菌組培苗。3種炭疽菌和草莓資源均保存于上海市農業(yè)科學院林木果樹研究所草莓課題組。

1.2 試驗方法

1.2.1UV-C輻射裝置

將UV-C紫外燈(λ=254 nm,TUV 25W/G25 T8,Philips)放入超凈工作臺(SW-CJ-1F,上海宇涵生物科技有限公司)中,使燈管距離工作臺面30 cm,開啟紫外燈5 min后,用輻照計(UV-B型雙通道,北京師范大學光電儀器廠)測量紫外燈管下30 cm處UV-C的輻照度為3.5 W/m2。當此UV-C紫外燈照射0、30、60、90 s和120 s時,各輻照時間下的輻照劑量分別為0、105、210、315 J/m2和420 J/m2;當照射4、6、8、10、12 min時,相應的輻照劑量為840、1 260、1 680、2 100、2 520 J/m2。照射過程中培養(yǎng)皿保持開蓋,周邊環(huán)境黑暗。下文將UV-C輻照30～120 s統(tǒng)稱為低輻照劑量,4～6 min為中輻照劑量,8～12 min為高輻照劑量。

1.2.2孢子懸浮液的制備

用手術刀從生長7 d的C.fructicola、C.gloeosporioides、C.siamense的新鮮菌餅上分別割取6個菌塊于30 mL馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB, Lot#9021639, 美國BD公司)培養(yǎng)基中,在搖床(DHZ-DA,蘇州培英實驗設備有限公司)上28℃、200 r/min培養(yǎng)7 d后用兩層擦鏡紙過濾到離心管中,取20 μL濾液于血球計數(shù)板上在顯微鏡(E200型,上海尼康儀器有限公司)下計數(shù),最終用無菌水稀釋,配制成1×106個/mL的孢子懸浮液。

1.2.3UV-C輻照對炭疽菌分生孢子存活的影響

用無菌水稀釋上述炭疽菌孢子懸浮液至孢子濃度為2×103個/mL,吸取50 μL至含0.08 g/L脫氧膽酸鈉(裂解細胞阻止菌絲生長)的25 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上并涂布均勻,之后立即放置在距離UV-C紫外燈下30 cm處照射,照射時間分別為0、30、60、90 s和120 s。紫外輻照結束后立即放入恒溫培養(yǎng)箱(SPX-150-GB型,上海萬銳實驗室設備有限公司)28℃ 黑暗下培養(yǎng),每個處理3次重復,本試驗獨立重復2次。

培養(yǎng)48 h后,計數(shù)每個培養(yǎng)皿上的菌落形成單位(colony forming unit, cfu),其分生孢子的相對存活率按以下公式計算:

相對存活率=(Mt/Mc)×100%[8]；

其中Mt指在輻照時間t下3個重復的平均cfu值,Mc指對照培養(yǎng)皿上的平均cfu值。

1.2.4UV-C輻照炭疽菌孢子對菌絲生長的影響

將孢子濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液滴在PDA平板上,每個平板滴3處,各10 μL,每個處理3皿,靜置5 min后在距離UV-C紫外燈下30 cm處分別照射0、2、4、6、8、10、12 min,輻照結束后立即放入恒溫培養(yǎng)箱28℃ 黑暗下培養(yǎng)。72 h后采用十字交叉法測量菌落直徑,本試驗獨立重復2次，計算菌絲生長抑制率。

抑制率=(未輻照處理菌落直徑-輻照處理后菌落直徑)/未輻照處理菌落直徑×100%。

1.2.5UV-C輻照炭疽菌菌絲對分生孢子產量的影響

C.fructicola、C.gloeosporioides、C.siamense28℃培養(yǎng)3 d后，在新鮮菌落外圍分別打取直徑為5 mm的菌塊,各取6塊置于滅菌的培養(yǎng)皿上,立即放置在UV-C紫外燈下30 cm處照射0、2、4、6 min。照射完畢后立即轉移至20 mL PDB液體培養(yǎng)基中,28℃、200 r/min培養(yǎng)3 d后用血球計數(shù)板測定分生孢子濃度,試驗獨立重復4次。

1.2.6UV-C輻照炭疽菌孢子和接種‘黃毛草莓’葉片

取5 mL 濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液置于直徑9 cm培養(yǎng)皿中,在UV-C紫外燈下30 cm處分別照射0、2、6 min。收集處理過的孢子懸浮液并在其中加入0.01% (V/V)的吐溫-20,混勻備用。

參考韓永超等[19]的草莓離體葉片接種方法,并略作修改。剪取‘黃毛草莓’無菌組培苗的葉片,在其葉柄傷口處裹上一層石蠟,用鑷子分別將其浸沒在上述經過UV-C處理的孢子懸浮液中,直到葉片上有水滴流下來為止,放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,每處理3皿,以不進行輻照處理孢子接種為對照。接種完成后用膜封口保濕,置于GXZ型智能光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)中,先在黑暗下25℃培養(yǎng)48 h,然后置于25℃,光周期L∥D=12 h∥12 h下培養(yǎng)。分別在接種后第3天和第5天調查發(fā)病情況,統(tǒng)計病情指數(shù)(disease index, DI),試驗獨立重復2次。

病情嚴重程度根據(jù)病斑總面積占葉片總面積的比例(A)來評價，共分6個等級:0級,健康葉片,沒有病斑;1級,0.1%50%[20]。病情指數(shù)計算公式如下:

1.2.7數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016軟件進行柱狀圖的繪制,用OriginPro 2019軟件繪制折線圖和箱圖,用IBM SPSS statistics(version 19)軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 UV-C輻照對炭疽菌分生孢子存活的影響

分生孢子懸浮液滴加在含有脫氧膽酸鈉的PDA平板上經UV-C照射后，置于28℃黑暗培養(yǎng)48 h，根據(jù)處理組與對照組cfu之間的比值(相對存活率)評價UV-C輻照對孢子存活的影響。從圖 1a可知，UV-C照射時間對3種炭疽菌分生孢子的相對存活率有顯著影響。在UV-C照射120 s(輻照劑量420 J/m2)時，3種炭疽菌的相對存活率在4%或以下。420 J/m2已接近分生孢子的致死劑量。

圖1 UV-C輻照不同時間對3種炭疽菌分生孢子相對存活率的影響Fig.1 Influences of different UV-C irradiation durations on the relative survival rate of conidia of three Colletotrichum species

除C.fructicola經UV-C照射120 s(輻照劑量420 J/m2)與照射90 s(輻照劑量315 J/m2)后孢子相對存活率差異不顯著外，隨著輻照時間從30 s增加到120 s(輻照劑量從105 J/m2增加到420 J/m2)，3種炭疽菌孢子的相對存活率顯著降低，說明3種炭疽菌孢子的相對存活率對UV-C輻照的劑量響應存在顯著差異。

3種炭疽菌中C.fructicola對UV-C輻照最為敏感。輻照后其孢子相對存活率最低，輻照30～120 s(輻照劑量105～420 J/m2)后相對存活率較對照下降了44%～98%，且顯著低于C.gloeosporioides。當UV-C輻照90 s(輻照劑量315 J/m2)時，C.gloeosporioides的孢子相對存活率仍維持在15% 以上，而另外兩種菌相對存活率均在10%以下，3種菌之間差異顯著。繼續(xù)延長輻照時間至120 s(輻照劑量420 J/m2)時，C.gloeosporioides的孢子相對存活率仍然顯著高于另兩種菌?？梢姡?種炭疽菌中C.gloeosporioides孢子對UV-C輻照的耐受性最強。

2.2 UV-C輻照對炭疽菌菌落生長的影響

不同輻照時間下，3種炭疽菌菌落直徑分布如圖2a所示。在中低輻照劑量(輻照時間30 s～6 min,輻照劑量105～1 260 J/m2)時，3種炭疽菌菌落直徑隨著輻照劑量增加，時間延長而下降，但在相同輻照劑量下，3種菌菌落直徑相差不大。當輻照時間延長至8 min(輻照劑量1 680 J/m2)時，C.fructicola和C.gloeosporioides部分菌落無法生長，且菌落直徑變化范圍較大，而C.siamense菌落都可生長。輻照時間增至10 min(輻照劑量2 100 J/m2)時，C.siamense也出現(xiàn)菌落不生長的情況。在輻照8 min及以上高輻照劑量處理下，炭疽菌菌落形成受到嚴重抑制，菌落大小有較大差異或僅部分接種點可形成菌落。

圖2 UV-C輻照不同時間對3種炭疽菌菌落生長的影響Fig.2 Influences of different UV-C irradiation durations on colony development of three Colletotrichum species

在中低輻照劑量(劑量≤1 260 J/m2，輻照時間≤6 min)下，3種炭疽菌菌落直徑變化如圖2b所示。隨輻照劑量增加，C.gloeosporioides和C.siamense的菌落直徑顯著降低，而C.fructicola經UV-C輻照6 min與輻照4 min的處理菌落直徑沒有顯著差異。C.siamense的菌落直徑最小，在未輻照或輻照2～4 min時菌落直徑顯著低于其他2種菌；輻照時間延長至6 min，C.siamense的菌落直徑顯著低于C.fructicola，而C.gloeosporioides與它們差異均不顯著。

2.3 UV-C輻照對炭疽菌分生孢子產量的影響

將經UV-C輻照不同時間的菌塊在PDB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3 d后分析產孢量(圖3),結果顯示，未經UV-C輻照的對照中,3種炭疽菌的產孢量從大到小排列:C.siamense>C.gloeosporioides>C.fructicola。隨著UV-C輻照時間的延長,3種炭疽菌產孢量均明顯下降,但當UV-C照射延長至6 min(輻照劑量為1 260 J/m2)時,C.fructicola的產孢量不降反升,其余兩種炭疽菌沒有觀察到這種現(xiàn)象。

圖3 UV-C輻照不同時間對3種炭疽菌產孢能力的影響Fig.3 Influences of different UV-C irradiation durations on the sporulation ability of three Colletotrichum species

2.4 UV-C輻照對炭疽菌在‘黃毛草莓’葉片上致病力的影響

用濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液噴霧接種‘黃毛草莓’葉片,觀察第3天和第5天的病癥嚴重程度,葉片上病程發(fā)展如圖4所示:隨著UV-C輻照時間的增加,3種炭疽菌導致的病情嚴重度逐漸下降(表1，表2)。

圖4 經UV-C輻照后3種炭疽菌對‘黃毛草莓’的致病力Fig.4 Pathogenicity of three Colletotrichum species to Fragaria nilgerrensis leaves after conidia exposed to UV-C irradiation

表1 UV-C輻照后的3種炭疽菌接種‘黃毛草莓’葉片所致的病情指數(shù)(3 dpi)1)Table 1 Disease indices of Fragaria nilgerrensis leaves after inoculation with UV-C treated conidia of three Colletotrichum species (3 dpi)

表2 UV-C輻照后的3種炭疽菌接種‘黃毛草莓’葉片所致的病情指數(shù)(5 dpi)Table 2 Disease indices of Fragaria nilgerrensis leaves after inoculation with UV-C treated conidia of three Colletotrichum species (5 dpi)

接種后5 d,未經UV-C照射的C.gloeosporioides所致病情指數(shù)最低,為59.26,與第3天不同的是,此時C.siamense所致病情指數(shù)略高于C.fructicola。UV-C照射2 min時,C.fructicola和C.gloeosporioides所致病情指數(shù)與對照相比大幅度下降,且與C.siamense存在顯著差異。C.siamense經過UV-C照射2 min,其所致病情指數(shù)與對照相比下降幅度小但與第3天相比大幅度上升。繼續(xù)延長UV-C輻照時間至6 min時,C.siamense所致病情指數(shù)與對照和輻照2 min相比大幅下降,C.gloesosporioides所致病情指數(shù)與輻照2 min相比下降幅度不大。

3 結論與討論

研究表明,低劑量的UV-B輻照能夠增強膠孢炭疽菌抗氧化能力[11],但低劑量UV-C輻照對炭疽菌病原影響尚無報道。本研究選擇病原菌抗性最強的細胞結構—孢子進行分析,結果表明,相比無輻照的對照組,輻照劑量為105 J/m2(輻照30 s)時,C.gloeosporioides,C.siamense和C.fructicola孢子活性都顯著下降,孢子相對存活率分別下降約8%，50%和30%。因此,估計100 J/m2以上的UV-C輻照劑量可以用于對3種炭疽菌的控制。UV-C 420 J/m2(輻照2 min) 對C.fructicola、C.gloeosporioides、C.siamense菌落生長抑制率分別為15%,11%,9%(圖2b)。Takeda等[13]使用55 W的UV-C燈在30 cm處輻照60 s(輻照劑量未知)可徹底抑制10 μL 104個/mL(約100個孢子)的膠孢炭疽菌菌株CG162孢子形成菌落。本研究采用25 W的紫外燈在30 cm處對約100個C.gloeosporioides孢子輻照120 s(輻照劑量420 J/m2)不能完全抑制其萌發(fā)；對總量104孢子的定點培養(yǎng)平板輻照12 min(輻照劑量2 520 J/m2)可抑制 89% 的C.gloeosporioides孢子萌發(fā)形成菌落。28℃新鮮生長3 d的C.gloeosporioides菌絲僅需輻照2 min 幾乎不能產孢,產孢量僅為無輻照的2.5%。因此,對草莓炭疽病菌來說,基因型、群體大小、輻照劑量和特定生命過程均影響其對UV-C的耐受性。

3種菌對UV-C的相對耐受性高低在不同生命過程表現(xiàn)不一致。菌絲產孢過程,C.gloeosporioides對UV-C輻照最敏感,C.siamense最耐受,可能與正常條件下其菌絲生長速度和產孢量差異有一定關系。在低密度孢子存活力方面,C.fructicola的孢子對輻照的耐受性最低,C.siamense耐受性居中,C.gloeosporioides表現(xiàn)的耐受性最高。在菌絲擴展過程,中低劑量UV-C(2～6 min，輻射劑量420～1 260 J/m2)下,3種炭疽菌孢子的菌絲擴展能力下降程度無顯著差異;輻照劑量增加到1 680 J/m2(輻照時間8 min)時C.siamense表現(xiàn)耐受性最強;更高劑量2 520 J/m2(輻照時間12 min)時,C.fructicola表現(xiàn)最耐受。

值得注意的是,C.fructicola的菌絲經輻照后形成孢子、或高密度孢子經輻照后形成菌落的試驗中,都發(fā)現(xiàn)這種菌雖然對UV-C輻照很敏感,但是對高劑量UV-C輻照表現(xiàn)出快速適應，由此推測,進一步提高輻照劑量也不一定能達到C.fructicola致死劑量。前人在研究140個馬鈴薯疫霉Phytophthorainfestans菌株對UV-C輻照的耐受性中發(fā)現(xiàn),這些菌株耐受紫外輻照的可塑性(plasticity)是遺傳力(heritability)的6～60倍,平均16倍[22]。C.fructicola對UV-C表現(xiàn)出很高的可塑性,這可能與紫外輻照降低DNA復制中細胞校對效率引起的誘變效應有關[23],但是基因突變通常會有生命力或適應性代價(fitness penalty),因此這種可塑性也離不開基因表達和/或酶活性改變[24]。在中低劑量UV-C輻照(輻照劑量420～1 260 J/m2)下,C.siamense不論產孢能力還是菌落形成能力均表現(xiàn)耐受性最強,推測這種菌在阻止或降低細胞內組分受到輻照傷害以及系統(tǒng)修復傷害能力相關的保護機制可能較強大[10]。

本研究發(fā)現(xiàn),無UV-C處理下,C.gloeosporioides致病力最低,接種后3 d以C.fructicola致病力最強,接種后5 d以C.siamense致病力最強。前人研究發(fā)現(xiàn) ‘阿爾比’草莓葉片接種經UV-C輻照3 min 的C.gloeosporioides3 d后,其病情指數(shù)比未經輻照的對照菌株處理下降50%以上[16]。本研究中C.gloeosporioides經過2 min或6 min輻照后,致病力與未經UV-C輻照的菌相比有所下降,但下降幅度不大,可能與所用菌株致病力較低有關。UV-C輻照2 min (輻照劑量420 J/m2)處理,C.fructicola和C.siamense對‘黃毛草莓’的致病力在接種后3 d顯著下降,其中C.fructicola致病力下降程度最大;但在接種后5 d,C.siamense處理的病情指數(shù)僅有小幅下降,表明該菌在此劑量下雖然前期致病力有下降但后期致病力未受到明顯抑制;中低輻照劑量處理,C.siamense對‘黃毛草莓’的致病力最強。對比分析UV-C對3種炭疽菌的致病力和生活力的影響,可發(fā)現(xiàn)早期致病力最強的C.fructicola對低劑量UV-C很敏感但對高劑量UV-C輻照表現(xiàn)出超出其他菌種的可塑性,而后期致病力更強的C.siamense對不同劑量的UV-C耐受性都比較強;孢子存活力方面,致病力最弱的C.gloeosporioides對UV-C的耐受性較強。鑒于炭疽菌對紫外線UV-C耐受的復雜性,可推論不同草莓炭疽病致病菌的致病力與其對UV-C的耐受性沒有明顯相關性。這一發(fā)現(xiàn)與馬鈴薯疫霉群體對UV-C的耐受性的研究結果類似,說明對UV-C耐受性強的基因型不存在或僅有低水平的適應性代價[22,25]。UV-C對炭疽菌和草莓這一植物病理系統(tǒng)的影響是復雜的。要將UV-C應用在控制炭疽病害上,需要立足草莓與炭疽菌互作,找到對草莓無傷害又能顯著降低幾種優(yōu)勢炭疽菌種生活力與致病力的輻照劑量。因此,今后有必要研究UV-C輻照對草莓植株的安全性,結合分析草莓形態(tài)發(fā)生、代謝過程和抗性反應等對UV-C不同劑量的響應,篩選對草莓無傷害又有抑制炭疽病菌效應的劑量,為探索草莓炭疽病物理控制提供更多有價值的參考。