陳思穎, 焦瑞蓮, 李志強(qiáng), 劉 政*, 李國(guó)英*

(1. 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 石河子 832003; 2. 新疆石河子開發(fā)區(qū)石大惠農(nóng)科技開發(fā)有限公司, 石河子 832003)

我國(guó)是世界葡萄與葡萄酒生產(chǎn)大國(guó),其中鮮食葡萄種植面積、產(chǎn)量均居世界第一位[1]。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局網(wǎng)站數(shù)據(jù)顯示,2019年,新疆葡萄產(chǎn)量為313.17萬(wàn)t,占我國(guó)葡萄總產(chǎn)量的22.06%,成為全國(guó)最大的葡萄生產(chǎn)基地。2019年,在新疆石河子發(fā)現(xiàn)一種葡萄果實(shí)新病害,多發(fā)生在有傷口的成熟葡萄果實(shí)上,病部常形成橄欖綠色霉層,受害部位通常凹陷,最后失水皺縮干枯，易脫落,嚴(yán)重影響葡萄的品質(zhì)。挑取葡萄病部橄欖綠色霉層在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量枝孢菌分生孢子。

枝孢菌廣泛分布于空氣、土壤、食品、水體中,可作為病原菌侵染多種作物,如辣椒[2]、柚[3]、葡萄[4-8]和棉花[9]等,少數(shù)種還可侵染動(dòng)物和人類[10-13]。關(guān)于葡萄枝孢菌的研究,Briceo等[5]從智利山谷‘赤霞珠’葡萄上分離到枝孢菌,并將其鑒定為枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides和多主枝孢C.herbarum。2003年,Gabler等[6]發(fā)現(xiàn)葡萄品種的感病性和果皮的完整性對(duì)病菌的侵染有重要的影響。1992年,張國(guó)敏等[7]在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)枝孢菌危害葡萄果實(shí),但未進(jìn)行種的鑒定。隨后,翟鳳艷等[8]從葡萄葉片上也分離到綠色枝孢C.viride。目前在新疆未見枝孢菌危害葡萄果實(shí)的報(bào)道。本研究通過形態(tài)學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定和致病性測(cè)定,確定了危害新疆葡萄果實(shí)的枝孢菌種類,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及病樣采集

2019年8月底到9月上旬,在石河子地區(qū)葡萄園的‘無核紫’葡萄上,發(fā)生了一種嚴(yán)重的爛果病,經(jīng)檢查病部表面有不少枝孢屬Cladosporium真菌的分生孢子。為進(jìn)一步查明病害的發(fā)生情況,2020年9月上中旬,對(duì)南北疆11個(gè)葡萄園的枝孢果腐病進(jìn)行了調(diào)查,記錄該病的典型癥狀,同時(shí)采集癥狀典型的病樣,供后續(xù)研究。

1.2 病原菌的分離、純化及代表菌株的選擇

采用常規(guī)稀釋分離法,對(duì)采集的病樣在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上進(jìn)行病原分離和單孢純化,根據(jù)采集地點(diǎn)、葡萄品種、菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度等選取代表性菌株,PDA試管斜面4℃保存,供后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1形態(tài)學(xué)鑒定

分離純化的21個(gè)代表性菌株接種在PDA培養(yǎng)基后,將無菌的蓋玻片以45°角斜插入培養(yǎng)基中(與接種菌塊距離為1.0～1.5 cm),在25℃條件下倒置培養(yǎng)5 d,待菌絲長(zhǎng)過插片的位置后取出玻片,觀察分生孢子梗和分生孢子著生方式,并測(cè)量50個(gè)分生孢子大小;用掃描電子顯微鏡(日本HITACHI SU8010,加速電壓5 kV,工作距離8 mm)對(duì)枝孢菌獨(dú)特的孢痕結(jié)構(gòu)、分生孢子梗和分生孢子表面紋飾進(jìn)行觀察并拍照。按Bensch等[14]的方法進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.3.2分子生物學(xué)鑒定

將純化后的21個(gè)供試菌株在PDA上,25℃培養(yǎng)10 d后用無菌刀片刮取菌絲體置于2 mL離心管中,用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(杭州博日科技有限公司)提取DNA。采用真菌ITS1和ITS4、編碼肌動(dòng)蛋白基因的ACT-512F和ACT-783R以及編碼翻譯延長(zhǎng)因子基因的TEF1-728F和TEF1-986R為引物對(duì)試驗(yàn)菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15-16]。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠(rDNA-ITS)和2%瓊脂糖凝膠(ACT、TEF1-α)電泳檢測(cè)后,將PCR產(chǎn)物連接至測(cè)序載體pMD 19-T上,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì),選取枝孢屬不同種同源性較高序列,利用軟件DNAMAN進(jìn)行比對(duì)分析。以甜菜生尾孢Cercosporabeticola(ITS、TEF1-α和ACT登錄號(hào)分別是AY840527、AY840494和AY840458)作為外群,用MEGA 7.0軟件采用最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,確定其分類地位。

1.4 致病性測(cè)定

用分生孢子懸浮液噴霧接種和菌絲球接種兩種方法進(jìn)行致病性測(cè)定。試驗(yàn)選用從葡萄園采摘的‘新郁’葡萄果實(shí),用75%乙醇對(duì)其表面進(jìn)行消毒,再用無菌水沖洗3次,置于滅菌吸水紙上晾干,用小型無菌注射器針頭將果面輕微刺傷。

分生孢子懸浮液噴霧接種:以不針刺噴霧清水和針刺后噴霧清水作為對(duì)照,用濃度為1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液進(jìn)行噴霧接種,均勻噴霧3次以使果面完全濕潤(rùn)。每個(gè)處理10粒葡萄,3次重復(fù),保濕培養(yǎng),每3 d觀察1次,記錄發(fā)病情況。對(duì)發(fā)病葡萄進(jìn)行病原菌分離,觀察分離菌株與接種菌株異同。

菌絲球接種:打取5 mm直徑菌餅放入馬鈴薯液體培養(yǎng)基中,置于25℃搖床150 r/min培養(yǎng)2 d。用移液槍吸取大小一致的單個(gè)菌絲球置于果面的刺傷部位,并以不放置菌絲球?yàn)閷?duì)照,保濕培養(yǎng)7 d后去除菌絲球,每個(gè)處理10粒葡萄,3次重復(fù),7 d后記錄發(fā)病情況,并對(duì)發(fā)病果面進(jìn)行再分離,觀察菌株與接種菌株的異同。

1.5 生物學(xué)特性測(cè)定

根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,選擇C4和C10分別代表枝狀枝孢C.cladosporioides和檸檬形枝孢C.limoniforme,進(jìn)行以下生物學(xué)特性的研究。枝孢菌產(chǎn)孢量大,用菌餅轉(zhuǎn)接極易在培養(yǎng)基上形成較多小菌落,因此生物學(xué)特性試驗(yàn)采用菌絲球接種。

1.5.1溫度對(duì)枝孢菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

吸取大小一致的單個(gè)菌絲球(菌絲球獲得同1.4)轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上,分別置于5、10、15、20、25、30、35℃的培養(yǎng)箱中,黑暗恒溫培養(yǎng)。每組處理3個(gè)重復(fù)。14 d后測(cè)量菌落直徑并拍照,之后在菌落半徑的1/2處打取5 mm的菌餅,取2個(gè)菌餅置于2 mL離心管中,加入1 mL無菌水,充分振蕩,得到分生孢子懸浮液(下同)。然后按常規(guī)血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定每個(gè)溫度下的產(chǎn)孢量,3次重復(fù),求其平均值。

1.5.2光照對(duì)枝孢菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

將菌絲球轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上,分別置于完全光照(24 h光照)、完全黑暗(24 h黑暗)和光暗交替(L∥D=12 h∥12 h)3種處理的培養(yǎng)箱中,25℃培養(yǎng)14 d,測(cè)量菌落直徑,每組處理3個(gè)重復(fù)。產(chǎn)孢量的測(cè)定方法同1.5.1。培養(yǎng)皿距離光源25 cm,光照強(qiáng)度為5 000 lx。

1.5.3pH對(duì)枝孢菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

用HCl和NaOH將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)節(jié)為4、5、6、7、8、9、10后滅菌,然后在無菌條件下,將菌絲球置于上述不同pH的PDA培養(yǎng)基上,25℃黑暗培養(yǎng)14 d,測(cè)量菌落直徑,每組處理3個(gè)重復(fù)。產(chǎn)孢量測(cè)定方法同1.5.1。

1.5.4枝孢菌的致死溫度測(cè)定

設(shè)置水浴鍋溫度為40、45、50、55、60、65、70℃,將裝有1mL濃度為1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液的離心管和裝有2個(gè)5 mm菌餅的離心管分別置于不同供試溫度的水浴鍋中處理10 min,取出冷卻至室溫后接種至PDA平板上,25℃黑暗培養(yǎng)5 d,根據(jù)PDA平板上是否有菌落生長(zhǎng)確定其致死溫度的范圍,再以1℃為溫度梯度重復(fù)上述步驟,連續(xù)進(jìn)行4次,確定其致死溫度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,用 SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間調(diào)查采樣及癥狀描述

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn),葡萄枝孢果腐病在11個(gè)調(diào)查的葡萄園中均有發(fā)生,范圍較廣,霉層多出現(xiàn)在有傷口的成熟葡萄果粒上。該病一般在8月下旬葡萄成熟后發(fā)生,特別在蟲害較多、裂果較重、或存在傷口的果實(shí)上發(fā)生較多。受害部位通常凹陷,最初病斑為近圓形小點(diǎn),后擴(kuò)展至整個(gè)傷口,并在病部形成橄欖綠至褐綠色霉層,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致整個(gè)果粒干枯。

2.2 病原菌的分離、純化及代表菌株的選擇

調(diào)查中共采集典型癥狀病樣80個(gè),經(jīng)分離共得到91個(gè)菌株。根據(jù)采集地點(diǎn)、葡萄品種、菌落生長(zhǎng)速度等特點(diǎn),選取代表性菌株21個(gè),具體采樣地點(diǎn)和品種見表2。

表2 21個(gè)代表菌株的來源及相關(guān)信息Table 2 The origin and related information of 21 representative strains

2.3 病原菌鑒定

2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定

供試21個(gè)菌株在PDA上25℃培養(yǎng)14 d后,菌落正面均呈深綠色或橄欖綠色,背面呈墨綠色;菌落呈絨毛狀或氈狀,菌絲有分隔,光滑或粗糙。光學(xué)顯微鏡下可見分生孢子梗單生,直立,有隔;分生孢子鏈狀,通常有多個(gè)分支,簇生或單生,有隔或無隔。分生孢子具有明顯帽(冠)狀結(jié)構(gòu)的孢痕(圖1a4, 圖1b4)。根據(jù)菌落生長(zhǎng)速度、分生孢子形狀、大小、表面紋飾將菌株分為兩類。

第一類:共20個(gè)菌株,在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快,14 d后菌落直徑為52.5～72.0 mm。初期菌落正面為橄欖綠色,背面為墨綠色,邊緣白色至無色透明;后期菌落正面顏色由內(nèi)至外呈綠色至灰綠色,培養(yǎng)基背面龜裂。菌落緊密呈絨毛狀,伴有同心輪紋。分生孢子梗直立或彎曲,單生,有隔,大小(41.36～269.76)μm×(3.27～5.84)μm。分生孢子多鏈生或單生,無隔或有隔,一般每鏈5～7個(gè)分生孢子,最多8個(gè)分生孢子。分枝分生孢子圓柱形、近卵圓形,大小(8.78～28.66)μm×(2.55～4.58)μm;次級(jí)分枝分生孢子卵圓形、長(zhǎng)橢圓形,大小(4.70～14.92)μm×(1.57～4.73)μm;中間分生孢子卵圓形、紡錘形,大小(4.57～10.11)μm×(2.57～4.38)μm;末端分生孢子卵圓形、近圓形,大小(2.90～8.19)μm×(1.69～3.50)μm。在掃描電鏡下,可觀察到分生孢子表面具有不規(guī)則網(wǎng)狀紋,其形態(tài)特征與枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides一致(圖1：a1～a4)。

圖1 引起葡萄枝孢果腐病的兩種菌株的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of two cladosporium strains causing grape fruits rot

第二類:只有1個(gè)C10菌株,在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢,14 d后菌落直徑為(32.4±5.5)mm。初期菌落正面為黃綠色,背面墨綠色,邊緣白色;后期菌落黃褐色,表面產(chǎn)生褶皺,培養(yǎng)基背面龜裂;菌落緊密為毛氈狀。分生孢子梗單生,有隔,大小(42.51～265.71)μm×(2.73～6.17)μm。分生孢子有隔或無隔,多鏈生或單生,一般每鏈5～7個(gè)分生孢子,最多8個(gè)分生孢子。分枝分生孢子橢圓形、長(zhǎng)梭形,大小(7.73～23.51)μm×(2.28～5.37)μm;次級(jí)分枝分生孢子長(zhǎng)梭形、長(zhǎng)卵圓形,大小(4.85～15.19)μm×(2.35～4.65)μm;中間分生孢子卵圓形、檸檬形,大小(4.43～9.74)μm×(2.51～4.15)μm;末端分生孢子卵圓形、圓形,大小(3.50～8.89)μm×(1.83～3.81)μm。在掃描電鏡下,可觀察到分生孢子表面具有倒鉤狀或刺狀突起,其形態(tài)特征與檸檬形枝孢Cladosporiumlimoniforme一致(圖1：b1～b4)。

2.3.2分子生物學(xué)鑒定

真菌通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增得到第一類菌株(C1～C9、C11～C21)片段大小為520 bp,在NCBI中BLAST比對(duì)結(jié)果顯示,與枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides(登錄號(hào)MH863917.1)、極細(xì)枝孢C.anthropophilum(登錄號(hào)MF472922.1)、瓜枝孢C.cucumerinum(登錄號(hào)HM148078.1)相似性分別為99.42%、98.80%、98.20%;第二類菌株(C10)擴(kuò)增產(chǎn)物為520 bp,與檸檬形枝孢Cladosporiumlimoniforme(登錄號(hào)KT600400.1)、枝細(xì)枝孢(登錄號(hào)EF679384.1)相似性分別為99.56%、99.12%。

肌動(dòng)蛋白基因引物ACT-512F/ACT-783R擴(kuò)增得到第一類菌株(C1～C9、C11～C21)產(chǎn)物為198 bp,與枝狀枝孢(登錄號(hào)HM148516)、極細(xì)枝孢(登錄號(hào)MF473348.1)相似性分別達(dá)到98.24%、88.83%;第二類菌株(C10)擴(kuò)增產(chǎn)物為197 bp,與檸檬形枝孢(登錄號(hào)KT600595.1)、多主枝孢C.herbarum(登錄號(hào)EF679521.1)相似性分別達(dá)到100%和84.21%。

翻譯延長(zhǎng)因子引物TEF1-728F/TEF1-986R擴(kuò)增得到第一類菌株(C1～C9、C11～C21)產(chǎn)物為215 bp,與枝狀枝孢(登錄號(hào)HM148244)相似性達(dá)到97.32%;第二類菌株(C10)擴(kuò)增產(chǎn)物為210 bp,與檸檬形枝孢(登錄號(hào)KT600497.1)相似性達(dá)到97.49%。

對(duì)供試菌株進(jìn)行多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果顯示第一類20個(gè)菌株,即C1～C9和C11～C21分別在兩個(gè)分支上,但均與枝狀枝孢聚在一起;第二類菌株C10與檸檬形枝孢聚在一起,形成一個(gè)分支;外群菌株甜菜生尾孢Cercosporabeticola與枝孢屬真菌分為兩個(gè)分支(圖2)。

圖2 基于 rDNA-ITS、TEF1-α、ACT 聯(lián)合序列的葡萄枝孢果腐病病原菌及相似種的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of cladosporium strains causing grape fruits rot and closely related species based on concatenated sequences of rDNA-ITS， TEF1-α， ACT

根據(jù)病原菌的形態(tài)特征及多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析,確定分離到的菌株均為枝孢屬Cladosporium,有2個(gè)種,分別是枝狀枝孢和檸檬形枝孢,其中枝狀枝孢占供試菌株的95.2%,為優(yōu)勢(shì)種。

2.4 致病性測(cè)定

根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果選擇代表菌株C4和C10進(jìn)行致病性測(cè)定。無傷接種,孢子懸浮液噴霧接種和菌絲球接種均不發(fā)病。采用有傷(針刺)接種,用孢子懸浮液和菌絲球接種均可使葡萄果實(shí)發(fā)病,一開始在傷口處出現(xiàn)淡色小點(diǎn),后斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大并出現(xiàn)橄欖綠色霉層。菌絲球接種(圖3f,g)比孢子懸浮液接種(圖3d,e)發(fā)病更快,癥狀也更為明顯;接種癥狀與田間發(fā)病癥狀一致(圖3a)。從接種發(fā)病后的病斑處再分離病原菌,分離到與接種所用菌株相同的菌株。

圖3 兩種枝孢菌接種成熟葡萄后引起的癥狀與成熟期自然發(fā)病癥狀Fig.3 Symptoms on mature grapes after inoculation with two Cladosporium species and natural symptoms at mature stage

2.5 兩種枝孢菌的生物學(xué)特性

2.5.1溫度對(duì)兩種枝孢菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

結(jié)果(表3)表明,在相同溫度條件下枝狀枝孢的生長(zhǎng)均明顯快于檸檬形枝孢;但兩種菌對(duì)溫度的反應(yīng)基本一致,即在10～30℃均可生長(zhǎng),在5℃和35℃時(shí)生長(zhǎng)極為緩慢,培養(yǎng)14 d菌落直徑不足5 mm(接到培養(yǎng)基上的菌絲球直徑為2 mm)。其最適生長(zhǎng)溫度為25℃,在25℃培養(yǎng)14 d,兩種枝孢菌的菌落直徑可分別達(dá)到(52.2±0.1) mm和(31.7±0.1) mm。

表3 溫度對(duì)兩種枝孢菌菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響1)Table 3 Effects of temperature on colony growth and sporulation capacity of two Cladosporium species

溫度對(duì)兩種菌產(chǎn)孢量的影響與對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響基本相同,均以25℃下產(chǎn)孢量最大,枝狀枝孢產(chǎn)孢量(7.38±0.11)×103個(gè)/mm2,檸檬形枝孢產(chǎn)孢量(6.14±0.13)×103個(gè)/mm2;其次為20℃和15℃,再次為30℃,10℃產(chǎn)孢量明顯減少,5℃和35℃時(shí)由于菌落基本不生長(zhǎng)對(duì)產(chǎn)孢量未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.5.2光照對(duì)兩種枝孢菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

3種光照條件下都表現(xiàn)為枝狀枝孢的生長(zhǎng)速度比檸檬形枝孢快，但枝狀枝孢的生長(zhǎng)對(duì)光照不敏感,在不同光照條件下,其生長(zhǎng)均沒有明顯差異;而檸檬形枝孢在不同光暗條件下生長(zhǎng)有差異,以完全光照條件下生長(zhǎng)最好。光照對(duì)枝狀枝孢的產(chǎn)孢量影響不大,但檸檬形枝孢在完全黑暗條件下產(chǎn)孢量較多(表4)。

表4 光照對(duì)兩種枝孢菌菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Table 4 Effects of illuminations on colony growth and sporulation capacity of two Cladosporium species

2.5.3pH對(duì)兩種供試枝孢菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

結(jié)果(表5)表明,兩種枝孢菌在pH 4～10條件下均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。枝狀枝孢適宜生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的pH為5～7(偏酸性環(huán)境),在pH為5～7時(shí),培養(yǎng)14 d菌落直徑可達(dá)到(53.0±0.1)mm,當(dāng)pH=6時(shí),產(chǎn)孢量最大,為(6.46±0.23)×103個(gè)/mm2。檸檬形枝孢在pH=7時(shí)生長(zhǎng)最快,產(chǎn)孢量最大。培養(yǎng)14 d菌落直徑可達(dá)到(35.8±0.1)mm,產(chǎn)孢量為(4.88±0.21)×103個(gè)/mm2。

表5 pH對(duì)兩種枝孢菌菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Table 5 Effects of pH on colony growth and sporulation capacity of two Cladosporium species

2.5.4兩種枝孢菌的致死溫度

將枝狀枝孢孢子懸浮液在52℃水浴鍋加熱10 min后,孢子不再萌發(fā),確定孢子致死溫度為52℃;將裝有枝狀枝孢菌餅的離心管60℃水浴鍋加熱10 min后,菌絲不再生長(zhǎng),確定菌絲致死溫度為60℃。

將檸檬形枝孢孢子懸浮液在50℃水浴鍋加熱10 min后,孢子不再萌發(fā),確定孢子致死溫度為50℃;將裝有檸檬形枝孢菌餅的離心管58℃水浴鍋加熱10 min后,菌絲不再生長(zhǎng),確定菌絲致死溫度為58℃。

3 結(jié)論與討論

2019年9月在新疆石河子地區(qū)葡萄果實(shí)上發(fā)現(xiàn)一種新的果實(shí)病害,只在成熟的果實(shí)上發(fā)現(xiàn),發(fā)病較重。為此2020年8、9月間在葡萄成熟期,對(duì)南北疆一些葡萄園進(jìn)行了普查,發(fā)現(xiàn)該病發(fā)生比較普遍,但主要在有傷口的成熟果實(shí)上出現(xiàn)。該病與Briceo等所報(bào)道的智利葡萄枝孢果腐病的發(fā)生時(shí)期完全一致[5],都是在果實(shí)成熟期發(fā)生,其優(yōu)勢(shì)菌種也相同,都是枝狀枝孢,但沒分離到多主枝孢,而分離到檸檬形枝孢。我們從葡萄果實(shí)上分離的枝孢菌形態(tài)與焦瑞蓮等報(bào)道的3種棉鈴枝孢菌中的兩個(gè)種[9],即枝狀枝孢和檸檬形枝孢一致,只是分生孢子的大小有差異,可能與其寄主植物不同有關(guān)。值得關(guān)注的是,2017年枝孢菌引起的棉鈴病害在新疆大發(fā)生,而2019年又開始發(fā)現(xiàn)葡萄枝孢果腐病,它們之間的關(guān)系如何？有待進(jìn)一步查明。

以形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ),經(jīng)分子生物學(xué)鑒定和致病性測(cè)定,明確了引起新疆葡萄枝孢果腐病的病原有兩種,即枝狀枝孢C.cladosporioides和檸檬形枝孢C.limoniforme,其中前者占95.2%,后者只占4.8%,枝狀枝孢為優(yōu)勢(shì)種。據(jù)形態(tài)觀察,枝狀枝孢和檸檬形枝孢具有枝孢屬共有的明顯特征冠狀孢痕,在枝狀枝孢分生孢子表面有不規(guī)則網(wǎng)紋,檸檬形枝孢分生孢子表面有明顯的倒鉤狀或刺狀突起,這些特點(diǎn)與Bensch等[14]及焦瑞蓮等[9]所描述的分生孢子形態(tài)基本一致。

兩種枝孢菌的生物學(xué)特性研究表明,在相同條件下枝狀枝孢的生長(zhǎng)速度明顯比檸檬形枝孢要快。兩者之間相同之處是:它們的適宜生長(zhǎng)和產(chǎn)孢溫度均為25℃,不同光暗條件下都可產(chǎn)生大量分生孢子。不同處是:光照對(duì)枝狀枝孢菌落生長(zhǎng)的影響不大,但檸檬形枝孢在光照條件下生長(zhǎng)較快,在完全黑暗條件下生長(zhǎng)最慢。枝狀枝孢的適宜生長(zhǎng)pH為5～7,檸檬形枝孢適宜生長(zhǎng)pH為7。另外兩者的致死溫度也不同,前者菌絲和分生孢子的致死溫度分別為60℃和52℃,后者為58℃和50℃。

接種試驗(yàn)表明,這兩種菌都是弱寄生菌,只能從傷口侵入。這和田間調(diào)查時(shí),一般害蟲為害較重的果園或受到人工及自然傷害的果園病害發(fā)生較重的情況是一致的。因此,在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過程中,采取各種措施減少鳥類蟲害和修枝疏果及雨水淋濕等造成的傷口,對(duì)預(yù)防和控制葡萄枝孢果腐病的發(fā)生可能具有重要作用。本研究結(jié)果明確了新疆葡萄枝孢果腐病病原菌及其生物學(xué)特性,為今后該病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)、發(fā)生規(guī)律和防治方法的研究打下基礎(chǔ)。