黃大野, 姚經(jīng)武, 鄭嬌莉, 王蓓蓓, 李 飛, 楊 丹, 曹春霞

(湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心, 國(guó)家生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心, 武漢 430064)

黃瓜CucumissativusL.是我國(guó)主要的蔬菜品種,種植面積居世界第一位[1-2]。由卵菌中瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum引起的黃瓜猝倒病是黃瓜苗期的主要病害,該病害在苗床育苗和移栽期間均能發(fā)生,可侵染種子、根或下胚軸引起種子或者幼苗死亡[3-4]。目前生產(chǎn)上缺少抗性品種,化學(xué)防治仍然是防控黃瓜猝倒病的主要手段,然而,連續(xù)使用同一種殺菌劑容易引起病原菌的抗藥性[5]。同時(shí),化學(xué)殺菌劑的使用也會(huì)造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留,所以生產(chǎn)上需要更為安全有效的防治方法。

生物防治由于無(wú)農(nóng)藥殘留和對(duì)環(huán)境友好,近年來(lái)在土傳病害防控上得到了廣泛的應(yīng)用[6-7]。Al-Hussini等[8]從番茄根際分離的蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus和菊微小桿菌Exiguobacteriumindicum聯(lián)合使用使番茄猝倒病發(fā)病率降低了27%。Halo等[9]從沙漠植物上分離的內(nèi)生菌Talaromycesvariabilis在盆栽試驗(yàn)條件下能使接種瓜果腐霉的番茄和黃瓜存活率分別增加33.92%和44.64%。Zouari等[10]報(bào)道解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens能有效防控番茄猝倒病的發(fā)生。淡紫褐鏈霉菌StreptomycesenissocaesilisNBF715是由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心從湖北省恩施州鶴峰縣土壤中分離和篩選出的一株鏈霉菌(CCTCC保藏號(hào): M2017414),前期研究表明,其對(duì)多種作物病害具有良好的抑菌活性。本研究通過(guò)鏈霉菌NBF715防控黃瓜猝倒病研究,為該菌的進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株:瓜果腐霉、多主棒孢Corynesporacassiicola、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、茄鏈格孢Alternariasolani、茶擬盤多毛孢Pestalotiopsistheae由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保存,用于抑菌譜的測(cè)定。淡紫褐鏈霉菌NBF715由本中心分離并保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，菌種專利保藏號(hào)為: M2017414。

供試藥劑:250 g/L吡唑醚菌酯乳油(EC),巴斯夫植物保護(hù)江蘇有限公司。

供試培養(yǎng)基:1)酪蛋白培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,葡萄糖1 g,酪蛋白5 g,L-酪氨酸0.1 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L,pH 7.4;2)鉻天青CAS培養(yǎng)基:鉻天青S 0.605 g,十六烷基三甲基溴化銨 0.729 g,FeCl·6H2O 2.645 mg,蛋白胨4.5 g,葡萄糖9 g,牛肉浸出粉2.7 g,NaCl 4.5 g，瓊脂20 g,蒸餾水1 L,pH 7;3)幾丁質(zhì)培養(yǎng)基:NH4H2PO41 g, KCl0.2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,1%膠體狀幾丁質(zhì)(m/V)100 mL,瓊脂20 g,蒸餾水1 L,pH 7;4)羧甲基纖維素鈉(CMC)培養(yǎng)基:NaNO32 g,KH2PO41 g,KCl 0.5 g,MgSO40.5 g,FeSO40.01 g,CMC-Na 10 g,蒸餾水1 L;5)淀粉培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g,蛋白胨5 g,NaCl 3 g,牛肉浸膏3 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L,pH 7;6)茯苓粉培養(yǎng)基:茯苓粉4 g,KH2PO46.8 g,Na2HPO417.9 g,酵母提取物6.7 g,苯胺藍(lán)0.06 g,瓊脂12 g,蒸餾水1 L,pH 6.8;7)高氏1號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g,NaCl 0.5 g,K2HPO4·3H2O 0.5 g,KNO31 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L,pH 7.4;8)ISP2培養(yǎng)基:酵母提取物 4 g,麥芽提取物 10 g,葡萄糖 4 g,瓊脂 15 g,蒸餾水 1 L,pH 7.3。

黃瓜購(gòu)自種子店,品種為‘帥兔’。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1NBF715菌株抑菌譜測(cè)定

NBF715菌株和植物病原菌分別在ISP2和PDA平板上活化備用。用直徑4 mm打孔器打取NBF715菌餅,置于平板中央兩側(cè),距離中心約30 mm,48 h后打取病原菌菌餅置于平板中央,以不加鏈霉菌NBF715作為對(duì)照,待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后測(cè)量菌落直徑,并計(jì)算抑菌率。

抑菌率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)]×100%。

1.2.2NBF715對(duì)瓜果腐霉菌絲形態(tài)影響

從對(duì)峙培養(yǎng)的平板中抑菌帶邊緣和對(duì)照菌落邊緣挑取菌絲,在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下觀察菌絲形態(tài)并拍照,掃描電鏡菌絲處理參考Li等的方法[11]。

1.2.3水解酶和產(chǎn)嗜鐵素活性測(cè)定1.2.3.1產(chǎn)嗜鐵素活性測(cè)定

使用打孔器打取NBF715菌餅接種于CAS培養(yǎng)基平板,28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d后觀察是否產(chǎn)生黃色暈圈[12]。

1.2.3.2水解酶活性測(cè)定

菌株分別接種于幾丁質(zhì)、酪蛋白、CMC、淀粉和茯苓粉培養(yǎng)基平板,28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d后觀察是否產(chǎn)透明圈[12-13]。其中酪蛋白平板需在培養(yǎng)后加入10%三氯乙酸。CMC平板需加入1 g/L 剛果紅，染色1 h后倒掉染液,再用1 mol/L NaCl溶液浸泡1 h。淀粉平板需加入2.5%盧氏碘液,浸泡15 min 后倒掉,用無(wú)菌水沖洗。

1.2.4NBF715發(fā)酵液對(duì)瓜果腐霉抑菌活性和對(duì)黃瓜猝倒病的防效

將NBF715菌株孢子從斜面培養(yǎng)基劃線至高氏1號(hào)平板,28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d后用4 mm打孔器打取菌餅至100 mL ISP2液體培養(yǎng)基,180 r/min,28℃振蕩培養(yǎng)5 d作為種子液,隨后按5%體積接入100 mL ISP2液體培養(yǎng)基,180 r/min,28℃振蕩培養(yǎng)7 d備用。將發(fā)酵液10 000 r/min離心15 min,取上清液用 0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌得到無(wú)菌發(fā)酵液。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)瓜果腐霉的抑菌活性。無(wú)菌濾液分別稀釋10、25、50倍和100倍,再與PDA以1∶9(V/V)混合，以加入相同體積無(wú)菌培養(yǎng)基作為對(duì)照,每處理3個(gè)重復(fù)。28℃黑暗培養(yǎng)至對(duì)照長(zhǎng)滿平板,測(cè)量對(duì)照和處理的瓜果腐霉菌落直徑,并計(jì)算抑菌率。

將瓜果腐霉在PDA平板上30℃黑暗培養(yǎng)3 d,用無(wú)菌手術(shù)刀切取邊長(zhǎng)15 mm的三角形菌絲塊作為接種的病原物,菌絲面朝上置于育苗基質(zhì)(草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1，體積比)表面。育苗基質(zhì)裝載量為距離穴盤表面2 cm處。黃瓜種子用1%次氯酸鈉浸泡2 min消毒,隨后用無(wú)菌水沖洗3次,置于濕潤(rùn)紗布中30℃催芽,隨后將黃瓜種子浸于發(fā)酵液原液和5倍稀釋液中30 min,對(duì)照藥劑為有效成分1 000 μg/mL吡唑醚菌酯,空白對(duì)照為無(wú)菌水。將各處理種子置于菌絲塊上,隨后覆上育苗基質(zhì),每處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)72粒種子。28℃光照培養(yǎng)10 d,統(tǒng)計(jì)出苗數(shù)并計(jì)算發(fā)病率和防效[14]。

發(fā)病率=(播種種子數(shù)量-正常苗數(shù)量)/播種種子數(shù)×100%;

防治效果=(對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對(duì)照發(fā)病率×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用 LSD 多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NBF715菌株抑菌譜

在供試的幾種病原菌中,NBF715菌株對(duì)瓜果腐霉抑菌活性最好,對(duì)峙培養(yǎng)2 d后出現(xiàn)明顯的抑菌帶(圖1),抑菌率達(dá)到55.6%(表1),對(duì)立枯絲核菌、茶擬盤多毛孢、多主棒孢、茄鏈格孢、膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌也具不同程度的抑菌活性。

圖1 NBF715菌株與瓜果腐霉對(duì)峙培養(yǎng)Fig.1 Confrontation culture between NBF715 strain and Pythium aphanidermatum

表1 NBF715菌株對(duì)植物病原菌離體抑菌效果1)Table 1 Inhibition effect of NBF715 strain on plant pathogens in vitro

2.2 NBF715菌株對(duì)瓜果腐霉菌絲形態(tài)的影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察,與對(duì)照菌絲相比,經(jīng)對(duì)峙處理的瓜果腐霉菌落邊緣菌絲出現(xiàn)明顯的扭曲、膨脹變形和消解(圖2)。在掃描電鏡下觀察,處理菌絲出現(xiàn)扭曲和破裂的情況(圖3)。

圖2 菌株NBF715處理后瓜果腐霉菌絲的顯微觀察Fig.2 Microscopic observation on mycelia of Pythium aphanidermatum treated by NBF715 strain

圖3 菌株NBF715處理后瓜果腐霉菌絲的掃描電鏡觀察Fig.3 Scanning electron microscopy observation on mycelia of Pythium aphanidermatum treated by NBF715 strain

1) 數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示經(jīng)最小顯著差異法檢測(cè)在0.05 水平差異顯著。下同。

The data marked with different lowercase letters are significantly different at 0.05 level base on least significant difference method. The same applies below.

2.3 NBF715產(chǎn)嗜鐵素能力和酶活性

通過(guò)離體定性試驗(yàn)表明,NBF715菌株能夠在CAS平板、淀粉平板、CMC平板和茯苓粉平板產(chǎn)生暈圈或透明圈(圖4),說(shuō)明其具有產(chǎn)嗜鐵素和淀粉酶、纖維素酶及β-1,3-葡聚糖酶能力。

圖4 菌株NBF715水解酶活性和產(chǎn)嗜鐵素能力Fig.4 Hydrolase activities of strain NBF715 and its ability to produce siderophore

2.4 NBF715發(fā)酵液對(duì)瓜果腐霉抑菌活性及對(duì)黃瓜猝倒病防控效果

NBF715無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)瓜果腐霉具有良好的抑菌活性,隨著發(fā)酵液濃度提高,抑菌率顯著提高,10倍和25倍稀釋發(fā)酵液抑菌率分別為84.1%和69.2%(表2)。

盆栽試驗(yàn)表明,NBF715發(fā)酵液浸種對(duì)黃瓜猝倒病具有良好的防控效果,經(jīng)NBF715菌株發(fā)酵液原液和5倍稀釋液浸種后發(fā)病率顯著降低,發(fā)酵液原液防效高于對(duì)照藥劑吡唑醚菌酯(表2)。

表 2 菌株NBF715發(fā)酵液對(duì)瓜果腐霉抑菌活性和黃瓜猝倒病的防效Table 2 Inhibitory effect of strain NBF715 fermentation broth on Pythium aphanidermatum and its control effect on damping-off of cucumber

3 結(jié)論與討論

本研究確定了淡紫褐鏈霉菌 NBF715對(duì)瓜果腐霉的離體抑菌活性、對(duì)菌絲形態(tài)的影響、抑菌譜、產(chǎn)嗜鐵素能力及水解酶活性和活體盆栽防效。

關(guān)于作物猝倒病的生物防控,之前的研究以生防細(xì)菌和生防真菌為主,如解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquefaciens[10],哈茨木霉Trichodermaharzianum,熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens[14-15]。本研究首次報(bào)道S.enissocaesilis對(duì)猝倒病防控效果。該菌種不僅對(duì)瓜果腐霉具有良好的抑菌作用,對(duì)其他6種常見的植物病原菌也具有良好的抑制作用,這些結(jié)果為其進(jìn)一步的研究提供了基礎(chǔ)。NBF715無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)瓜果腐霉具有良好的抑菌作用,需要進(jìn)一步對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定。經(jīng)NBF715處理的瓜果腐霉菌絲,發(fā)生扭曲、膨脹和消解,可能是其一種抑菌機(jī)制。Chen等[16]報(bào)道Streptomycessp.CB-75處理尖孢鐮刀菌后菌絲發(fā)生變形、收縮、坍塌和彎曲,本研究與其結(jié)果相似。

嗜鐵素是生防菌產(chǎn)生的最普遍的抑菌代謝產(chǎn)物,菌株超強(qiáng)螯合能力的鐵載體螯合了環(huán)境中痕量的鐵,能有效地與病原菌競(jìng)爭(zhēng)鐵離子從而抑制病原菌生長(zhǎng)[17-18],NBF715菌株和瓜果腐霉競(jìng)爭(zhēng)鐵離子可能是其一個(gè)重要的抑菌機(jī)制。纖維素酶、淀粉酶和β-1,3-葡聚糖酶是植物病原真菌細(xì)胞壁的降解酶[19],NBF715菌株具有上述3種細(xì)胞壁降解酶活性,表明其具有破壞瓜果腐霉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的能力,該結(jié)果與光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察結(jié)果一致。

本文只進(jìn)行了發(fā)酵液的活性評(píng)價(jià),還需進(jìn)行菌劑的防控效果研究,為產(chǎn)品的登記和田間應(yīng)用推廣奠定基礎(chǔ)。